ГОСТ Р ИСО 10993-4—2009
Три аналитических метода получили наибольшее распространение при определении концентрации общего
гемоглобина крови НЬ(70).
П р и м е ч а н и е — Исследовательдолжен учитывать, что ряд факторов может вносить искажения в резуль
таты тестирования гемолитической активности. Химические агенты некоторых видов, содержащиеся в медицин
ских материалах и растворах, способны воздействовать на осмотическую стойкость эритроцитов (например, фикси
рующие агенты, такие как формапьдегид или глутаровый альдегид), провоцировать осаждение эритроцитов
(например, ионы меди или цинка), изменять спектры поглощения гемоглобина (например, полиэтиленгликоль или
этанол) [64). (65).
С.6.1.2 Определение концентрации общего гемоглобина крови
С.6.1.2.1 Гемоглобинцианидный метод
Первый из классических методов определения концентрации общего гемоглобина крови — гемоглобинциа
нидный — был опубликован Международным Комитетом по Стандартизации в Гематологии (International
Committee for Standardization In Haematology) [71). Гемоглобинцианидный анализ удобен тем, что легко может быть
автоматизирован идля него доступны прямые стандарты (HiCN). Метод основан на окислении гемоглобина спосле
дующим образованием циангемоглобина. имеющего максимум поглощения при 540 нм. Детергент, используемый
в качестве лизирующего агента, помимо высвобождения гемоглобина из эритроцитов снижает мутность раствора
(источник помех и ошибок при фотометрировании на 540 нм) за счет преципитации белков. При использовании дан
ного метода спектральные помехи со стороны плазмы минимальны, что позволяет сравнивать поглощение образ
цов плазмы непосредственно с контрольным раствором.
Широкая полоса поглощения HiCN позволяет для ручного и автоматического определения использовать не
только точные спектрофотометры, но и простые фотоколориметры с фильтрами. Применение эталонных образцов
позволяет добиться сопоставимости результатов, полученных при использовании данного метода в разных лабо
раториях. Основной недостаток метода связан с необходимостью использовать высокотоксичные растворы циани
дов. способные к тому же выделять синильную кислоту в процессе кислого гидролиза. Определенные трудности и
расходы связаны с утилизацией опасных отходов.
С.6.1.2.2 Оксигемоглобиновый метод
Второй из классических методов определения концентрации общего гемоглобина крови — оксигемоглобино
вый — в настоящее время не находит широкого применения. Оксигемоглобиновый метод основан на образовании
НЬ02 в процессе обработки гидроксидом аммония и последующем спектрофотометрическом определении этого
продукта. Применяют также регистрацию оксигемоглобина в разбавленном растворе карбоната натрия. Метод не
имеет стабильных контрольных или стандартных образцов, что. впрочем, не столь важно, поскольку данный метод
может быть использован в техслучаях. когда результат (концентрацию гемоглобина в плазме) представляют в про
центах от концентрации общего гемоглобина крови. В таком случае стандартный образец (образец со 100 %-ным
гемолизом) готовят из забранной крови непосредственно перед измерением.
С.6.1.2.3 Железный метод
Третий из классических методов определения концентрации общего гемоглобина крови основан на опреде
лении концентрации ионов железа, выделенныхиз гемоглобина крови взаимодействием с кислотой или озолением.
Полученные препараты титруют TiCI3 или обрабатывают специфическими агентами, взаимодействующими с желе
зом. с последующим фотометрированием окрашенных комплексов. Данный метод слишком сложен для рутинных
измерений и потому используется редко.
С.6.1.3 Измерение свободного гемоглобина плазмы
С.6.1.3.1 Прямые оптические и дополнительные химические методы
Благодаря многочисленным различным факторам (традициям, простоте применения, утилизации жидких
отходов, доступности стандартов и т.д.) для определения концентрации свободного гемоглобина плазмы как инди
катора гемолиза, в настоящее время применяют около 20 методов, но ни один из них не распространен широко. Все
методы могут быть разделены на две большие группы:
1 Использующие регистрацию поглощения непосредственно оксигемоглобина (при 415. 541 и 577 нм) и его
производных:
2 Использующие регистрацию поглощения производных гемоглобина, полученных путем химических пре
вращений (гемоглобин реагирует с бензидин-лодобными хромогенами и перекисью водорода, или из него форми
руют циангемоглобин) (72).
Анализы всех видов могут быть выполнены как в ручном режиме, так и автоматически.
Популярный метод измерения концентрации гемоглобина основан на его катализирующем эффекте при
окислении производных бензидина. например, окислении тетраметилбензидина перекисью водорода. Скорость
образования окрашенного продукта (определяется фотометрически при 600 нм) прямо пропорциональна концен
трации гемоглобина. К преимуществам этого метода можно отнести простоту автоматизации с привлечением ком
мерчески доступной аппаратуры, отсутствие высокотоксичных и экологически опасных реагентов или отходов
(синильная кислота иее производные), доступность стандартных образцов гемоглобина, откалиброванных против
стандартных образцов HiCN. Нижний предел чувствительности метода (5 мг/л) сравним с таковым для гемоглобин-
цианидного метода [70J. Основным недостатком этого метода является использование потенциально опасных для
здоровья лроизводныхбензидина, а также высокие расходы на утилизацию реагентов и продуктов. Более того,див-
20