ГОСТ Р 57130—2016
ровку. Оценка преципитации может осуществляться на глаз или при помощи инструментальных мето
дов. таких как световая микроскопия, отслеживая осадок, который сохраняется либо появляется в
процессе культивирования (к концутерапии).
Цитотоксичность
При проведении цитогенетическиханализов in vitroхромосомныхаберраций вметафазелибо мик-
роядерных проб цитотоксичность может приводить к снижению роста клеток не более чем на 50 % (при
мечания 9 и 10). Для MLA максимальной дозой должна быть доза, вызывающая 80—90 %-ную
цитотоксичность, измеряемая по RTG впределах20—10 % (примечание 9).
П р и м е ч а н и е 9
Несмотря на то. что некоторые генотоксичные канцерогены не определимы в рамках анализов геноток-
сичности in vitro, кроме случаев, когда исследуемые концентрации индуцируют определенную степень цито
токсичности. препараты, повреждающие ДНК. обычно определяют лишь при среднем уровне токсичности
(Greenwood etat.. 2004). По мере роста цитотоксичности другие механизмы, помимо прямого поврежденияДНК
веществом или его метаболитами, могут привести к получению «положительных» результатов, обусловлен
ных цитотоксичностью, а не генотоксичностью. Подобная косвенная индукция повреждения ДНК вследствие
повреждения не ДНК-структур. вероятнее всего, может возникнуть при концентрации, превышающей опреде
ленный порог. Нарушения клеточных процессов не предполагаются при более низких фармакологически акту
альных концентрациях.
В цитогенетических анализах даже слабые кластоаены с канцерогенными свойствами дают положи
тельный результат, не достигая 50 %-ного снижения числа клеток. С другой стороны, вещества, не обладаю
щие повреждающим ДНК эффектом, мутагенным либо канцерогенным потенциалом, могут вызывать поломку
хромосом в токсических концентрациях. Для цитогенетических анализов т vitro, анализа хромосомных аберра
ций и микроядерной пробы in vitro целесообразным является предельное снижение роста на 50 %.
Для цитогенетических анализов вклеточныхлиниях изменение популяции клетокстечением времени (за
счет измерения изменения числа клеток во время культивирования относительно контроля, например, мето
дом удвоения популяции (PD. примечание 10). является полезным параметром оценки цитотоксичности,
поскольку известно, что подсчет числа клеток может привести к недооценке токсичности. Для культур лим
фоцитов подавление пролиферации, не превышающее около 50 %. считается достаточным, что может быть
определено по митотическому индексу (МИ) для анализа аберраций в метафазе и по индексу, основанному на
блокировке цитокинеза для микроядерных тестов in vitro. Кроме того, для микроядерного теста in vitro, посколь
ку микроядра оценивают в интерфазе после митотического деления, необходимо подтвердить прохождение
клетками клеточного цикла. Этого можно достичь за счет использования цитохалазина В для обеспечения
ядерного деления, а не клеточного деления, так что микроядра можно оценить в двухъядерных клетках (пред
почтительный метод в случае анализа в лимфоцитах). Для клеточных линий могут применяться другие мето
ды. показывающие пролиферацию клеток, включая рост популяции с течением времени (PD). как описано выше
(Kirsch-Volders etat.. 2003).
Для MLA достаточной чувствительности можно достичь за счет ограничения максимальной концентра
ции. близкой к 20% относительного общего роста (RTG) (10—20 %) для методов с использованием как мягкого
агара, так и микролунок (Moore etai.. 2002). Анализ опубликованных данных с использованием текущих
критери ев определил малое количество веществ с положительным результатом MLA только в
концентрациях менее 20 % RTG. представляющих собой канцерогены для крыс, при этом отсутствуют
убедительные свидетель ства генотоксического канцерогенеза для данной категории. По общему мнению,
необходимо с осторожнос тью подходишь к интерпретации результатов при увеличении мутации ниже
20 % RTG. и результат не считался бы положительным при увеличении мутантной фракции при H 0% R T G
.
Таким образом, следует с осторожностью подходить к интерпретации результатов в виде снижения
роста/выживаемости или превышающих 50 % для цитогенетического анализа либо 80% — для MLA. Установ
лено. что оценка клеток, обрабатываемых при данном уровне цитотоксичности/клонапьной выживаемости,
может лривест ик повышению чувствитепьности. но и к более высокому риску нерелевантных положительных
результатов. Батарейный подход к анализу генотоксичности должен обеспечить необходимую чувствитель
ность. не опираясь на индивидуальные анализы в клетках грызунов in vitro при высокой цитотоксичности.
Для достижения соответствующегодиапазона токсичности необходимо проведение предварительного
исследования по подборудиапазона доз в широком диапазоне концентраций, но при проведении анализа геноток
сичности зачастую важно использовать различные концентрации с достаточно близкими интервалами (менее
чем двукратная степень разведения). Дополнительные концентрации возможно исследовать, ноне все концен
трации следует оценивать на предмет генотоксичности. Не предполагается проведения множественных экс
периментов до достижения четкого 50 %-ного снижения роста либо четкого 80 %-ного снижения RTG.
П р и м е ч а н и е 10
Для цитогенетических анализов in vitro целесообразно использовать параметры относительного роста
клеток с целью оценки токсичности, поскольку при подсчете клеток токсичность может быть недооценена
(Greenwood etat.. 2004). При помощирасчетного удвоения популяции (см. Гпоссарий)для оценки 50 %-ного уровня
7