ГОСТ 33638—2015
6 Жидкость, содержащую сперму, вносят в пробирку, пытаясь исключить какие-либо фрагменты ткани се
менников.
7 800 мкп конечного раствора Хэнкса добавляют в пробирку и хорошо перемешивают.
8 При необходимости самец может быть законсервирован фиксацией в 100 %-ном этаноле или другом тре
буемом фиксаторе. Это имеет особое значение, если исследование определяет родительское происхождение по
томков.
Оплодотворение
1 Крупных беременных самок идентифицируют из требуемой популяции, самки готовы к выдавливанию
икры, только когда можно увидеть яйца, выступающие из клоаки. Готовые самки имеют характерную позу с «при
поднятым головным концом».
2 Аккуратно проводят указательным пальцем или большим пальцем вниз к хвосту рыбы для стимуляции
выделения яйцевого мешка в приготовленную чашку Петри. Повторяют с другой стороны и рьбу возвращают в
резервуар.
3 Яйца распределяют (образуя монослой) с помощью тонкой кисточки. Важно подвергнуть воздействию
сперматозоидов как можно больше яиц. поскольку максимизация площади поверхности яиц полезна.
П р и м е ч ан и е — Яйца хранят влажными, положив влажную ткань вокруг них (важно чтобы яйца непо
средственно не касались воды, поскольку это может преждевременно сделать твердым хорион, что предотвраща ет
оплодотворение). Существуют большой разброс в количестве яиц. которое может произвести каждая самка, но в
среднем примерно 150 яиц можно легко получить от одной беременной самки.
4 25 мкл спермы в смеси Хэнкса равномерно распределяют по всей поверхности яиц с помощью кисточки.
Яйца быстро затвердевают и меняют цвет (в течение одной минуты), как только начинается оплодотворение. Если
расчетное число яиц составляет более 150. то процедуру повторяют. Аналогично, если яйца не затвердевают в
течение минуты, то добавьте немного больше спермы.
П р и м е ч ан и е—Добавление большего количества спермы необязательно улучшит показатель
оплодотворения.
5 Яйца и сперме должны быть оставлены для взаимодействия не менее чем на 15 мин. а оплодотворенные
яйца помещают в аквариумы, в которых проводится испытание, в течение 1.5 ч после оплодотворения.
6 Процедуру повторяют с использованием другой самки, пока не будет собрано необходимое количество яиц.
7 Отбирают несколько яиц из последней партии и фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте.
Подсчет и распределение яиц в испытательные аквариумы
1 Яйца должны быть равномерно распределены между каждым уровнем обработки, чтобы избежать гене
тического смещения. Каждую партию оплодотворенных яиц разделяют на группы равного размера (на количество
уровней обработки) с помощью тупого инструмента (например, широким лезвием энтомологических щипцов или
бактериологической петлей). Если в испытании для каждой обработки имеется четыре повторности по 20 яиц каж
дая. то нужно распределить 80 яиц в аквариумы, в которых проводится испытание.
П р и м е ч ан и е — Рекомендуется добавить еще 20 % яиц (то есть 96 яиц в каждую обработку), пока есть
гарантия того, что можно получить 100%-ный показатель оплодотворения.
2 Яйца колюшки очень подвержены грибковым инфекциям за пределами гнезда, которое охраняет самец. В
связи с этим очень важна обработка всех яиц метиленовой синькой в течение первых 5 суток испытания. Стоковый
раствор метиленовой синьки готовят в концентрации 1 мг/мл и добавляют в аквариумы, в которых проводится ис
пытание. чтобы получить максимальную конечную концентрацию 2,125 мг/л.
П р и м е ч ан и е — Колюшки не должны подвергаться воздействию метиленовой синьки, поскольку после
выпупления успокаивающие системы должны быть свободны от метиленовой синьки на шестые сутки.
3 Яйца ежедневно проверяют и регистрируют мертвые или неоплодотворенные яйца.
П р и м е ч ан и е — Пока они вылупляются, яйца никогда не должны находиться вне воды, даже на очень
короткий период времени.
28