ГОСТ 33638—2015
метода, используемого в данной лаборатории. Причиной меж- и внутрилабораторной вариабельности
(вероятнее всего) являются различные стадии развития в популяции рыб. С учетом вариабельности
определения VTG значения NOEC. основанные только на одной конечной точке, следует интерпретиро
вать с большой осторожностью. Имеются различные аналитические методы оценки синтеза VTG на ви
дах рыб. используемых в настоящем методе. Относительно чувствительной и специфичной методикой
проведения измерения является определение концентрации белка с помощью иммуноферментного
твердофазного анализа (ELISA). Следует использовать гомологичные антитела (продуцированные на
VTG у рыбы того же вида) и наиболее широко применяемые гомологичные стандарты.
7.9 Определение пола
7.9.1 В зависимости от процедуры отбора проб для анализа VTG целую рыбу или оставшуюся
среднюю часть каждой рыбы помещают в предварительно промаркированные кассеты для гистологи
ческой проводки и фиксируют в соответствующем фиксаторе для гистологического определения пола
(при необходимости также для определения стадии гонад). Руководство по фиксации и заливке приве
дено в приложении Е, а также в руководстве ОЭСР по диагностике гистопатологии гонад рыб. связанной с
эндокринной системой [27]. После проводки образцы рыбы заливают в парафиновые блоки. Образцы
располагают в продольном направлении в парафиновом блоке. Делают не менее шести продольных
срезов (толщиной 3-5 мкм) во фронтальной плоскости, включая ткань гонад из обеих гонад от каждой
особи. Интервал между этими срезами должен составлять примерно 50 мкм для самцов и 250 мкм для
самок. Однако поскольку каждый блок будет часто включать и самцов и самок (если более одной особи
залито в каждый блок), то интервал между срезами в этих блоках должен равняться примерно 50 мкм до
тех пор, пока не будет получено не менее шести срезов гонад от каждого самца. После этого интер вал
между срезами можно увеличить приблизительно до 250 мкм для самок. Срезы окрашивают гема
токсилином и эозином и исследуют с помощью световой микроскопии, обращая особое внимание на
пол (самец, самка, гермафродит или недифференцированные). Гермафродит определяется по нали
чию более чем одного ооцита в семеннике на шесть проанализированных срезов или сперматогенных
клеток (да’нет) в яичниках. Гистопатология и определение стадии яичника и семенника не являются
обязательными, но если такие исследования проводятся, то результаты подвергают статистическому
анализу и регистрируют. Следует отметить, что у некоторых видов рыб в норме отсутствует полностью
развившаяся пара гонад, и может присутствовать только одна гонада (например, у японской оризии. а
иногда и у данио-рерио). Все такие наблюдения должны быть зарегистрированы.
7.9.2 Определение генетического пола у особей японской оризии основано на присутствии или от
сутствии гена DMY, определяющего пол самцов, находящегося в Y-хромосоме. Генотипирование пола
оризии проводят секвенированием гена DMY из ДНК. экстрагированной, например, из части анального
или спинного плавника. Присутствие гена DMY указывает на особь XY (самец) независимо от феноти па.
а отсутствие DMY указывает на особь XX (самка) независимо от фенотипа [28]. Рекомендации по
подготовке тканей и проведению PCR приведены в приложении И. Определение генетического пола у
особей трехиглой колюшки также выполняют с помощью метода PCR. описанного в приложении К.
7.9.3 О наличии гермафродитов (см. раздел 2) указывают в отчете.
7.10 Вторичные половые признаки
Вторичные половые признаки находятся под контролем эндокринной системы у таких видов, как
японская оризия, поэтому наблюдения за внешним видом рыбы, если это возможно, производят по
окончании воздействия испытуемого вещества. У самок японской оризии папиллярные образования на
задней части анального плавника являются андрогензависимыми признаками.
Соответствующие фотографии вторичных половых признаков у самцов и андрогонизированных
самок приведены в [41].
8 Данные и отчет о проведении испытания
8.1 Обработка результатов
Важно, чтобы самый мощный обоснованный статистический критерий определял конечную точку.
Повторность является экспериментальной единицей, но вариабельность внутри повторности включают в
статистическую проверку. Блок-схема для принятия решения при определении наиболее подходящих
статистических критериев при обработке характеристик полученных экспериментальных данных пред-
9