ГОСТ 33638—2015
Приложение
Л
(рекомендуемое)
Руководство по отбору проб тканей для определения генетического пола
с использованием PCR у трехиглой колюшки
Отбор проб тканей и экстракция ДНК
ДНК экстрагируют с помощью различных промышленно доступных реактивов и ручных или автоматизиро
ванных систем экстракции. Протокол, используемый в лаборатории CEFAS Weymouth, описан ниже и добавлены
альтернативные методы в случае необходимости.
1 Небольшой кусочек ткани (10-20 мг) из дорсолатеральной области (после удаления головы и хвоста для
анализа VTG) срезают тонкими ножницами у каждой отдельной рыбы. Ткань вносят в пробирку или непосредствен но
помещают в жидкий азот (для хранения при температуре - 80 "С), или заливают 70%-ным этанолом (для транс
портировки и последующего хранения при температуре 4 ’С). Ножницы очищают после каждой рыбы в 70%-ном
этаноле, затем в дистиллированной воде и высушивают салфеткой.
2 Этанол (если присутствует) удаляют аспирацией, а ткань переваривают в течение ночи с использовани
ем протеиназы К в 400 мкл буфера ATL (Qiagen). Аликвотную порцию перевара (200 мкл) переносят в 96-луноч-
ный S-блок (Qiagen) и ДНК экстрагируют в 96-луночном формате, используя автоматизированный аппарат Qiagen
Universal BioRobot и набор реагентов Qlamp Investigator BioRobot. ДНК элюируют в воду с 50 мкл ДНКазы и несо-
держащую РНКазу. При использовании твердых тканей для извлечения ДНК (например, образцы позвоночника
или грудного плавника) может быть необходима гомогенизация образца в лизирующем буфере с применением
аппарата для лизирования тканей FastPrep® или эквивалентной системы для разрушения ткани.
Альтернативно
а) Ткань переваривают в течение ночи с использованием протеиназы К в 400 мкл лизирующего буфера G2
(Qiagen) и ДНК экстрагируют из 200 мкл перевара с помощью набора для экстракции ДНК из тканей EZ-1 и авто
матизированного аппарата для экстракции ДНК EZ-1 или с помощью мини-набора для экстракции ДНК из тканей.
ДНК элюируют в объеме 50 мкл.
б) Ткани обрабатывают с использованием реагента DNAzol для экстракции ДНК. Вкратце, образцы тканей
лизируют в 1 мл реагента DNAzol в течение 10 мин в пробирке для микроцентрифуги емкостью 1,5 мл и затем цен
трифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин для удаления всех твердых частиц. Затем лизированный образец
переносят в новую пробирку для микроцентрифуги емкостью 1.5 мл. содержащую 500 мкл 100%-ного этанола для
работ в молекулярной биологии, а затем центрифугируют при 13000 об/мин в течение 10 мин для осаждения ДНК.
Этанол удаляют и замещают 400 мкл 70%-ного этанола для работ в молекулярной биологии, центрифугируют при
13000 об/мин в течение 5 мин и осадок ДНК растворяют в 50 мкл воды с молекулярной ДНКазой и несодержащей
РНКазу. Вновь при использовании твердых тканей (например, грудного плавника) может потребоваться гомогени
зация образца в лизирующем буфере с применением аппарата для лизирования тканей lyser FastPrep® или экви
валентной системы для разрушения ткани перед экстракцией ДНК.
3 ДНК хранят при температуре - 20 ’С до использования.
П р и м е ч ан и е — Все манипуляции проводят в перчатках.
Анализ полимеразной цепной реакции (PCR)
Амплификацию проводят с использованием 2.5 мкл экстракта ДНК в объеме реакции 50 мкл с использовани
ем праймеров для локуса Idh (как описано Peichel и др.. 2004 Current Biology 1:1416-1424):
- прямой праймер -♦ 5‘ GGG ACG AGC AAG ATT TAT TGG 3’;
- обратный праймер -» 5’ TAT AGT TAG CCA GGA GAT GG 3’.
Существует множество поставщиков подходящих ПЦР реактивов. Метод, описанный ниже, в настоящее вре
мя используется в лаборатории Cefas Weymouth.
1 Приготовление «реакционной смесив (50 мкл на образец):
- Реакционную смесь Mastermix готовят следующим образом. Ее можно приготовить заранее и хранить
замороженной при температуре - 20 ’С до использования. Готовят достаточное количество реакционной смеси
Mastermix для отрицательного контроля (только вода для работ в молекулярной биологии).
ОбъемКонечная концентрация
(стоковый концентрат)/образец
Реакционный буфер 5xGoTaq®
10 мкл1х
MgCI2
Нуклеотиды (дАТФ. дЦТФ. дГТФ, дТТФ)
Прямой праймер
5 мкл (25 мм)
0.5 мкл (по 25мМ каждого)
0.5 мкл (0.1 нмоль/мкл)
2.5 мМ
250 мкМ каждого
2.0 мкМ
25