ГОСТ 33638—2015
Приложение К
(рекомендуемое)
Руководство по отбору проб тканей для определения генетического пола
и для определения генетического пола с помощью PCR-метода
Отбор проб тканей, подготовка и хранение перед определением генетического пола с помощью PCR
у оризии (подготовлено
Л
абораторией водных организмов из Bayer CropScience AG)
1 Анальный или спинной плавник срезают тонкими ножницами у каждой отдельной рыбы и помещают в пробир
ку. заполненную 100 мкл буфера для экстракции 1(подробнее о подготовке буфера см. ниже). Ножницы хорошо очища
ют после обработки каждой рыбы в химическом стакане сдистиллированной Н20 и высушивают бумажной салфеткой.
2 Затем ткани плавника гомогенизируют с помощью тефлонового пестика в микропробирке для лизиса кле
ток. Для каждой пробирки используют новый пестик для предупреждения любого загрязнения. Пестики помешают
на ночь в 0.5М NaOH, промывают в течение 5 мин в дистиллированной Н20 и хранят до использования в этаноле
или стерильными после автоклавирования.
3 Также ткани плавника можно хранить без буфера для экстракции 1 на сухом льду и затем при температуре
- 80 "С в холодильнике для предупреждения разрушения ДНК. Но экстракция проходит лучше, если одновременно
экстрагируют ДНК (обработка см. выше: образцы оттаивают на льду после хранения при температуре - 80 "С до за
полнения пробирок буфером).
4 После гомогенизации все пробирки помещают на водяную баню и кипятят в течение 15 мин при темпера
туре 100 "С.
5 Затем 1С0 мкл буфера для экстракции 2 (подробнее о подготовке буфера см. ниже) вносят пипеткой в каждую
пробирку. Образцы хранят при комнатной температуре в течение 15 мин и периодически осторожно встряхивают рукой.
6 После этого вое пробирки помещают на водяную баню и снова кипятят в течение еще 15 мин при темпе
ратуре 100 "С.
7 Пробирки замораживают при температуре - 20 ’С до следующего анализа.
Приготовление буфера:
1 PCR-буфер 1:
а) 500 мг N-лауроилсаркозина (например. Merck KGaA. Darmstadt. GE);
б) 2 мл 5М NaCI;
в) до 100 мл дистиллированной Н20.
Затем автоклавируют.
2 PCR-буфер 2:
а) 20 г Килекса (например Biorad. Munich. GE):
б) Дают набухнуть в 100 мл дистиллированной Н20.
Затем автоклавируют.
Определение генетического пола (с использованием PCR) у оризии (подготовлено
Л
абораторией
водных организмов из Bayer CropScience AG и Universitat Wurzburg Biozentrum)
Подготовленные и замороженные пробирки (описанные в предыдущем разделе) оттаивают на льду. После
этого их центрифугируют с использованием центрифуги Эппендорфа (30 с при максимальной скорости, при ком
натной температуре). Для PCR используют прозрачную надосадочную жидкость, отделенную от осадка. Необхо
димо полностью избегать переноса следов Килекса (находящихся в осадке) в PCR-реакцию, поскольку это
будет оказывать отрицательное влияние на активность полимеразы Taq. Надосадочную жидкость используют
сразу же или хранят в замороженном виде (при минус 20 VC), и затем повторно оттаивают в несколько циклов без
негатив
ного воздействия на ДНК для последующих анализов.
1 Приготовление «реакционной смеси» (25 мкл на пробу):
Обьем
Конечная концентрация
ДНК-матрица 0.5 мкл-2 мкл
ЮхПЦР-буфер с МдС12
Нуклеотиды (каждый из дАТФ. дЦТФ. дГТФ. дТТФ)
2.5 мкл1х
4 мкл (5 мМ) 200 мкМ
0.5 мкл 200 нм
0.5 мкл 200 нм
Прямой праймер (10 мкМ) (см. пункты 3-5)
Обратный праймер (10 мхМ) (см. пункты 3-5)
ДМСО 1.25 мкл 5 %
Вода (ПЦР класс)
Taq Е-полимераза
до 25 мкл
0.3 мкл1.5 Ед.
ЮхПЦР-буфер с MgCI2:
670 мм Триа’НС! (pH 8.8 при 25 "С).
160
m
M(NH4)2SO4.
25 мМ МдС12. 0.1% Твин 20.
22