ГОСТ 33638—2015
7.7 Отбор проб для анализа VTG и определения пола
с помощью гистологического исследования
7.7.1 Всю рыбу отбирают и подготавливают для определения пола и VTG. Для определения пола
проводят гистологический анализ всей рыбы. Для измерения VTG берут подгруппу не менее из 16 рыб из
каждой повторности. Если полученные результаты по подгруппе являются неопределенными, то ана лиз
VTG проводят на большем количестве рыбы.
7.7.2 Процедура отбора проб для анализа VTG и определения пола зависит от метода анализа
VTG.
7.7.2.1Метод с гомогенатом головного/хвостового концов для анализа VTG
Рыбу подвергают эвтаназии. Голову и хвост каждой рыбы отделяют от тела срезами, сделанными
непосредственно сзади грудных плавников и непосредственно сзади спинного плавника, с помощью
скальпеля {см. рисунок 1). Головную и хвостовую часть от каждой рыбы объединяют, взвешивают, ин
дивидуально нумеруют, замораживают в жидком азоте и хранят для анализа на VTG при температу ре
- 70 °С или ниже. Часть туловища рыбы нумеруют и фиксируют в соответствующем фиксаторе для
последующего гистологического анализа [27]. С использованием данного метода анализа VTG и гисто
патологии оценивают каждую особь, и. таким образом, возможное изменение уровня VTG может быть
связано с фенотипическим полом рыбы или генетическим полом рыбы (японской оризии и трехиглой
колюшки). Дополнительная информация приведена в приложениях Г и Д.
7.7.2.2 Метод с гомогенатом печени для анализа VTG
Рыбу подвергают эвтаназии. Печень извлекают и хранят при -70 °С или ниже. Рекомендуемые про
цедуры для извлечения печени и предварительной обработки приведены в TG 229 [40] или 230 [41]. За тем
печень от каждой рыбы гомогенизируют по отдельности, как описано в TG 229 и 230. Собранную
надосадочную жидкость используют для измерения VTG с использованием ELISA (см. для примера ко
личественной оценки приложение Д для данио-рерио или TG 229 для японской оризии). Следуя данному
подходу, также можно иметь соответствующие данные по каждой рыбе как поVTG. так и гистологии гонад.
7.7.2.3 Метод с плазмой крови для анализа VTG
Отбирают кровь отанестезированной рыбы сердечной пункцией, срезом хвостовой вены илихвоста, и
центрифугируют при температуре 4 "С для получения плазмы. До использования плазму хранят при темпе
ратуре - 70 °С или ниже. Всю рыбу подвергаютэвтаназии и фиксируют для гистологическогоисследования.
Для соответствия VTG с полом рыбы пробы плазмы крови и рыбы нумеруют по отдельности.
7.7.2.4 Определение генетического пола
Биологическую пробу для определения генетического пола отбирают индивидуально от каждой
рыбы, имеющей соответствующий видовой маркер. У японской оризии отбирают анальный или спинной
плавник. В приложении И приведено подробное описание, включая отбор проб тканей и определение
пола с помощью PCR-метода. Аналогично для трехиглой колюшки в приложении К приведено описание
отбора проб ткани и определение пола PCR-методом.
7.8 Измерение VTG
Измерение VTG должно основываться на количественно и аналитически валидированном методе.
Должна быть представлена информация по внутрилабораторной и межлабораторной вариабельности
Срез сзади спинного плавника
Рисунок 1 — Способ приготовления срезов рыбы для измерения VTG
в гомогенате головного/хвостового концов и гистологической оценки средней части
8