ГОСТ 33638—2015
Приложение Г
(рекомендуемое)
Руководство по гомогенизации головной и хвостовой частей
от неполовозрелых данио-рерио, черного толстоголова,
трехиглой колюшки и японской оризии
Целью этого раздела является описание процедуры, выполняемой перед количественным определением
концентрации VTG. Можно использовать другие процедуры, которые приводят к сопоставимой количественной
оценке VTG. Настоящий вариант представляет возможный дизайн определения концентрации VTG в плазме крови
или печени вместо гомогената головного и хвостового концов.
Процедура
1 Рыбу подвергают анестезии и эвтаназии согласно описанию испытания.
2 Отрезают голову и хвост от туловища рыбы согласно описанию испытания. В обязательном порядке следу
ет промыть и очистить надлежащим образом все инструменты, используемые для препарирования, и разделочную
доску (например. 96% этанолом) между обработкой каждой отдельной рыбы, чтобы предотвратить «загрязнение
проб VTG» от самок или от индуцированных самцов к неиндуцированным самцам.
3 Определяют массу объединенных головной и хвостовой частей от каждой рыбы с точностью до мг.
4 После взвешивания образцы помещают в соответствующие пробирки (например, пробирки Эппендорфа
емкостью 1,5 мл) и замораживают при температуре - 80 X перед гомогенизацией или сразу же гомогенизируют на
льду с использованием двух пластиковых пестиков. (Могут быть использованы другие методы, если они выполня
ются на льду и в результате получается гомогенная масса.) В обязательном порядке пробирки должны быть про
нумерованы надлежащим образом так. чтобы головная и хвостовая часть рыбы соответствовала их отсеченному
туловищу, которое будет использоваться для гистологии гонад.
5 Когда гомогенная масса достигает значения, в 4-10 раз превышающего массу ткани, то добавляют буфер
для гомогенизации’ (обращают внимание на разведение). Продолжают проводить гомогенизацию пестиками, пока
смесь не станет однородной.
П р и м е ч ан и е : Для каждой рыбы следует использовать отдельные пестики.
6 Пробы помещают на лед до центрифугирования, которое проводят при температуре 4 ’С с частотой вра
щения 50000 g в течение 30 мин.
7 С помощью пипетки порции от 20 до 50 мкл (отмечают количество) надосадочной жидкости вносят не ме
нее чем в две пробирки путем погружения наконечника пипетки ниже жирового слоя на поверхности и осторожным
всасыванием надосадочной жидкости без жира или фракции осадка.
8 Пробирки хранят при температуре - 80 ’С до использования.
* Буфер гомогенизации:
50 мМ трис-HCI pH 7.4; 1% смесь ингибиторов протеаз (Signra): 12 мл Трис-HCI pH 7.4 + 120 мкл смеси инги
биторов протеаз (или эквивалентных смесей ингибиторов протеаз).
ТРИС: трис-ULTRA PURE (ультра чистый) (ICN).
Коктейль ингибиторов протеаз: от Sigma (для тканей млекопитающих). Номер товара (продукта) Р 8340.
П р и м е ч ан и е — Буфер для гомогенизации следует использовать в день его приготовления. Во время
использования буфер помещают на лед.
16