ГОСТ 33638—2015
Приложение Е
(рекомендуемое)
Руководство по подготовке тканевых срезов для определения пола и стадии гонад
Целью этого раздела является описание процедуры, проводимой перед оценкой гистологических срезов.
Могут быть использованы другие процедуры, которые дают аналогичные результаты при определении пола и ста
дии гонад. За некоторым исключением эти процедуры аналогичны для японской оризии (JMD) и данио-рерио (ZF).
Эвтаназия, вскрытие и фиксация тканей
Цели:
1 Рыбу подвергают эвтаназии гуманным способом.
2 Проводят определение массы тела и другие необходимые измерения.
3 Оценивают вторичные половые признаки.
4 Извлекают ткань для анализа VTG.
5 Фиксация ткани гонад.
Процедуры:
1 Рыба умерщвляют непосредственно перед аутопсией. Если в испытании не участвует несколько патолого
анатомов. то несколько рыб не должно умерщвляться одновременно.
2 Используя небольшой сачок, рыбу извлекают из экспериментальной камеры и переносят в транспортном
контейнере в место проведения аутопсии.
3 Рыбу помещают в раствор для эвтаназии. Рыбу вынимают из раствора, когда происходит остановка дыха
ния и рыба не реагирует на внешние раздражители.
4 Рыбу взвешивают влажной.
5 Для приготовления тканей для проведения анализа VTG рыбу помещают на пробковую доску на подставке
препаровальной лупы.
а) у данио-рерио голову отрезают непосредственно сзади грудного плавника, а хвост отрезают непосред
ственно сзади спинного плавника:
б) у японской оризии брюшину вскрывают с помощью тщательно сделанного разреза, проходящего по вен
тральной средней линии брюшины от грудного пояса до точки непосредственно к анусу. Используя небольшие
щипцы и маленькие ножницы, осторожно извлекают печень.
6 Образцы для анализа VTG помещают в пробирки Эппендорфа и немедленно замораживают в жидком азоте.
7 Тушку, включающую гонады, помещают в предварительно маркированную пластиковую кассету для тка
ней. которую переносят в фиксатор Дэвидсона или Боуэна. Объем фиксатора должен не менее чем в 10 раз пре
вышать объем ткани. Контейнер с фиксатором осторожно перемешивают в течение пяти секунд, чтобы удалить
пузырьки воздуха из кассеты.
8 Все ткани оставляют в фиксаторе Дэвидсона на ночь, затем на следующий день их переносят в отдельные
контейнеры с 10 % нейтральным буферным раствором формалина. Контейнеры с кассетами осторожно переме
шивают в течение 5 с для обеспечения адекватного проникновения формалина в кассеты.
в) Ткани остаются в фиксаторе Боуэна в течение 24 ч. а затем их переносят в 70%-ный этанол.
Обработка тканей
Цели:
Ткани обезвоживают для адекватного проникновения парафина:
Ткани пропитывают парафином для поддержания целостности тканей и получения прочной поверхности для
приготовления гистологических срезов.
Процедуры:
1 Маркированные кассеты для тканей удаляют из смеси формалин/этанол. в которой они хранились, и кас
сеты помещают в корзину(ы) для проводки. Корзины для проводки загружают в гистопроцессор.
2 Выбирают график проводки образцов.
3 После завершения цикла проводки в гистопроцессоре корзину(ы) переносят на станцию парафиновой заливки.
Заливка
Цель:
Правильно расположить образец в затвердевшем парафине для приготовления гистологических срезов.
Процедуры:
1 Корзину(ы) с кассетой извлекают из процессора и погружают в заполненную парафином переднюю камеру
термоконсоли станции парафиновой заливки, или кассеты переносят в отдельный парафиновый нагреватель.
2 Первую кассету, предназначенную для запивки, извлекают из передней камеры термоконсоли или пара
финового нагревателя. Крышку кассеты снимают и отбрасывают, а маркировку кассеты проверяют на соответствие по
каждой рыбе для предупреждения возможных расхождений до заливки.
18