ГОСТ 33638—2015
Для каждой реакции PCR (см. пункты 3-5) требуется специальный праймер в качестве новой комбинации
типа «реакционной смеси» и адекватное необходимое количество ДНК-матрицы для каждого образца (см. выше).
Соответствующие объемы переносят в новые пробирки с помощью пипетки. После этого все пробирки закрывают,
перемешивают (приблизительно 10 с) и центрифугируют (10 с при комнатной температуре). Затем запускают со
ответствующие PCR-программы. Кроме того, помимо опытных образцов в каждой PCR-программе используют по
ложительный контроль (стандартный образецДНК (контрольная ДНК-магрица) с известной активностью и четкими
результатами) и отрицательный контроль (1 мкл дистиллированной Н20).
2 Подготовка агарозного геля (1 %) во время цикла PCR-программы:
- раствор кипятят в микроволновой печи (приблизительно 2-3 мин);
- горячий раствор переносят в специальную камеру для горизонтального электрофореза, находящуюся на
льду;
- примерно через 20 мин гель агарозы готов к применению;
- агарозный гель в 1хТАЕ-буфере хранят до окончания PCR-программы.
3 PCR-программа для актина
Данная PCR-реакция предназначена для демонстрации того, что ДНК в пробе не повреждена.
- специальный праймер:
- «М действие 1 (верхний/ прямой)» -» ТТС AAC AGC ССТ GCC ATG ТА;
- «М действие 2 (нижний/обратный)» — GCA GCT CAT AGC ТСТ ТСТ CCA GGG AG.
- Программа:
- 5 мин при 95 "С;
- цикл (35 раз):
- денатурация -* 45 с при 95 "С:
- отжиг -»45 с при 56 "С;
- элонгация -♦ 1 мин при 68 "С;
- 15 мин при 68 ’С.
4 PCR-программа для генов X- и Y-хромосом
Образцы с неповрежденной ДНК используют в данной PCR-лрограмме для выявления X- и Y-генов. ДНК
самцов должна показать одну двойную полосу, а ДНК самок должна показать одну-единственную полосу (после
окрашивания и гель-электрофореза). В данный анализ необходимо включить один положительный контроль для
самцов (XY-образец) и один для самок (ХХ-образец).
- Специальный праймер:
- «PG 17.5» (верхний/прямой) - CCG GGT GCC CAAGTG СТС CCG CTG; -
«PG 17.6» (нижнийобратный) — GAT CGT ССС ТСС АСА GAG AAG AGA. -
Программа:
- 5 мин при 95 "С.
- цикл (40 раз):
- денатурация -* 45 с при 95 "С;
- отжиг — 45 с при 55 ’С;
- элонгация -♦ 1 мин 30 с при 68 ”С:
- 15 мин при 68 *С.
5 PCR-программа для гена Y-хромосомы в качестве «контроля» для PCR-программы для генов X- и
Y-хромосом:
Данная PCR-программа проверяет результаты «PCR-программы для генов X- иY-хромосом». «Образцы сам
цов» должны показывать одну полосу, а «образцы самок» не должны показывать какой-либо полосы (после окра
шивания и гель-электрофореза).
- Специальный праймер:
- «DMTYa (верхний/прямой)» -♦ GGC CGG GTC ССС GGG TG;
- «DMTYd (нижний/обратный)» — ТТТ GGG TGAACT САС ATG G.
- Программа:
- 5 мин при 95 "С.
- цикл (40 раз):
- денатурация -» 45 с при 95 "С:
- отжиг — 45 с при 56 *С;
- элонгация -* 1 мин при 68 "С;
- 15 мин при 68 ’С.
6 Окрашивание образцов PCR:
- Окрашивающий раствор:
- 50 % глицерин:
- ЮОмМЭДТА;
- 1 % SOS;
23