ГОСТ 33638—2015
2.0 мкМ
Обратный праймер
Вода для работ в молекулярной биологии
GoTaq полимераза
0.5
мкл
(0,1
моль/ мкл)
30.75 мкл
0,25 мкл
1.25 Ед.
- Вносят 47,5 мкл в маркированную тонкостенную пробирку для ПЦР вместимостью 0.5 мл.
- Добавляют 2.5 мкл очищенной ДНК в маркированную пробирку. Указанные манипуляции повторяют для
всех образцов и отрицательных контролей.
- Покрывают 2 каплями минерального масла. Альтернативно используют амплификатор с подогреваемой
крышкой.
- Крышки закрывают.
- Образцы денатурируют в амплификаторе Peltier РТС-225 при (94
±
2) “С в течение 5 мин с последующими
39 циклами при (94
±
2)"С в течение 1 мин. при (55
±
2) *С в течение 1 мин. при (72
±
2) "С в течение 1 мин. а окон
чательное наращение проводится при (72
±
2)"С в течение 10 мин.
2 Приготовление агарозного геля (2 %-ного)
Традиционно продукты PCR разделяют на 20 %-ном агарозном геле, содержащем бромистый зтидий. Также
могут быть использованы системы капиллярного электрофореза.
- Взвешивают 2 г агарозы в 100 мл 1хТАЕ-буфера.
- Нагревают в микроволновой печи (около 2-3 мин) для растворения агарозы.
- Добавляют 2 капли бромистого этидия до конечной концентрации 0.5 мкг/мл.
Горячий раствор переносят в устройство для заливки геля. Гелю дают возможность затвердеть.
3 Гель-электрофорез:
- агарозный гель переносят в камеру для электрофореза и погружают в 1хТАЕ-буфер:
- 20 мкл каждого образца вносят в отдельную лунку, добавляя маркер молекулярной массы (ДНК «линейка»
100 п.н., Ргогледа) в запасную лунку;
- электрофорез проводят при 120 V в течение 30-45 мин.
4 Визуализация продуктов амплификации
Если бромистый зтидий был включен в агарозный гель, как описано выше, то продукты ДНК визуализируют
под источником УФ-света. Альтернативно агарозный гель окрашивают, лохрывая гель разбавленным раствором
бромистого этидия (0.5 мкг/мл в воде) в течение 30 мин перед визуализацией.
26