ГОСТ ISO 15163—2014
Далее погружают конец входной трубки перистальтического насоса (5.1) в стакан, содержащий не
менее 50 см3 буферного раствора III (4.12.3). Собирают вторую элюированную фракцию в другую мер
ную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3(5.5). Собирают точно до метки 50 см3или до объема 47
см3. В последнем случаеобъем доводятдо метки буферным раствором III (4.12.2).
Затем собирают пробув количестве 3 см3в небольшойстакан, которую обозначают как вторичную
фракцию.
П р и м е ч а н и е — Первая элюированная фракция содержит химозин. Промежуточную фракцию исполь
зуют для проверки правильности разделения двух ферментов. Вторая элюированная фракция содержит говяжий
пепсин. Используя вторичную фракцию, проверяют полноту извлечения пепсина.
Если известно, что пробасодержиточень малоеколичество химозина или пепсина, элюированные
фракции 1и 2 можно собрать в небольшие мерные колбы, например вместимостью 25 см3.
7.6.2Разделение химозина и пепсина на оборудовании для FPLC®/AKTA®,HPLC.
Автоматический ввод
7.6.2.1 Следуютобщим инструкциям к оборудованию (5.6)и колонке MonoQ (4.1). используя толь
кобуферные растворы I (4.12.1) иIV (4.12.4).
Составляют программу проведения анализа. Проверяют правильность разделения и соответ
ствиеполученныхрезультатов ручному контрольномуметоду. При автоматическом вводехроматограм
мадана суменьшением на коэффициент 5.тоестьсобирают 10 см3фракциивместо 50см3,отбираемых
ручным способом. Кроме того, нет необходимости собирать промежуточную фракцию, потому что хро
матограмма показывает, разделены ли химозин и пепсин полностью на фракции с одним ферментом в
каждой.
Если колонка не использовалась в течение последних 24 ч, проводят «слепой» опыт, используя
буферный раствор I (4.12.1)в качестве пробыдляанализа.
7.6.2.2 При объеме пробы 0.5 или 1.0 см3следуютуказанным рекомендациям попрограмме испы
таний.
a) Начинаютсо 100 %-ного буферного раствора I (4.12.1) прискорости потока 2см3/мин ирегист
рируютего надлине волны 280нм. Вводятпробуобъемом0.500см3или 1.000см3,котораябылапредва
рительно введена в петлю, в колонку.
b
) После элюирования 0.60 см3 буферного раствора I (4.12.1) начинают собирать фракцию 1
(фракция химозина).
c) После элюирования 1.50 см3буферного раствора Iего заменяют на буферную смесь, состоя
щую из80 %буферного раствора I(4.12.1) и20 % буферного раствора IV (4.12.4)дляэлюированияфрак
ции химозина.
d) После элюирования смеси, состоящей из соответственно 10,60 см3 буферного раствора I и
буферного раствора IV. останавливаютсборфракции 1(объем 10 см3)идля элюирования исборафрак
ции 2(фракция пепсина)заменяютсмесь буферов Iи IV насмесь, состоящую из 50 % буферного раство ра
I (4.12.1) и50 % буферного раствора IV (4.12.4).
e) После элюирования 20.60 см3буферной смесиостанавливаютсборфракции 2(объем 10см3) и
для промывания колонки заменяют смесь из 50 % буфера I и IV на 100 %-ный буферный раствор
IV (4.12.4).
f) После элюирования 25.60 см3 буферной смеси для уравновешивания колонки заменяют
полностью буферный раствор IV на буферный раствор I(4.12.1).
д) После элюирования 32.60 см3 буферного раствора Iзавершают программу.
7.6.2.3 Хроматографию пробы проводятследующим образом.
Предварительно вводят обессоленный ферментный препарат в петлю объемом 0.500 или
1.000 см3с молокосвертывающей активностью не более 180 ММЕ. Начинают проведение хроматогра
фии исобираютдве фракции. Определяютвремясвертывания первой ивторойфракций всоответствии
cISO 11815|IDF 157.
Если известно, что образец содержит очень небольшое количество химозина (фермент из сычуга
телят) или пепсина (фермента изсычуговкрупного рогатогоскота), размер фракции может быть измененна 5
см3, так как небольшое количество одного из ферментов элюируется в первые 5 см3фракции, которые
могут бытьпроверенынахроматограмме. Если весь ферментэлюируется в первые 5 см3фракции, тоактив
ность измеряют только вэтойфракции ирасчеткорректируют путем деления молокосвертывающей актив
ности на два. Приэтом время свертывания остальных 5 см3фракциидолжнобыть не более 1800 с.
В целом рекомендуется вводить пробу известного состава через равные промежутки времени, в
частности, при использовании автоматизированного метода.
Регулируют программу, если разделение фракции химозина и пепсина неявляется полным.
6