ГОСТ 30812—2021
б) синтез ПЦР-продуктов (60 циклов):
1) денатурация ДНК — при температуре 95 °С в течение 10 с,
2) отжиг праймеров — при температуре 52 °С в течение 10 с,
3) синтез цепи ДНК — при температуре 60 °С в течение 4 мин;
в) охлаждение — при температуре 12 °С постоянно.
Примечание — Допускается хранение продукта реакции секвенирования в закрытой микропробирке
при температуре не выше минус 18 °С сроком не более 12 мес.
5.6.5 Определение последовательности нуклеотидов
5.6.5.1 Для обессоливания и очистки продукта секвенирования в предварительно подготовленную
колонку типа Centri-Sep наносят образец, полученный по 5.6.4 в полном количестве, после чего центри
фугируют при рекомендованной скорости.
5.6.5.2 В микропробирку вместимостью 0,2 см3 вносят 10 мм3 препарата с очищенным образцом
по 5.6.5.1, добавляют 12 мм3 высокоочищенного формамида, предназначенного для денатурации ну
клеиновых кислот перед капиллярным электрофорезом.
5.6.5.3 Пробирку с образцом, растворенным в формамиде по 5.6.5.2, ставят в амплификатор и
подвергают тепловой денатурации при температуре 95 °С в течение 2 мин.
5.6.5.4 Полученный анализируемый образец по 5.6.5.3 в формамиде переносят в 96-луночный
планшет, закрывают уплотнителем и размещают в держателе для анализируемых образцов согласно
инструкции по эксплуатации прибора для капиллярного электрофореза.
5.6.5.5 Подготовленный по 5.6.5.4 анализируемый образец, содержащий продукт секвенирования
ДНК, разделяют методом капиллярного электрофореза с детекцией сигнала флуоресценции в соответ
ствии с инструкцией по эксплуатации прибора для капиллярного электрофореза. При этом выбирают
протокол для секвенирования ДНК, рекомендуемый к данному прибору.
5.7 Обработка и оформление результатов идентификации
5.7.1 Все результаты идентификации оценивают по каждой пробе отдельно.
5.7.2 Для видовой идентификации сравнивают полученную по 5.6.5 последовательность нукле
отидов 3’ участка контрольного региона мтДНК с известными последовательностями в базе данных.
Пример результатов секвенирования мтДНК приведен в приложении Д.
5.7.3 Таксономическую принадлежность (биологический вид) устанавливают на том уровне, кото
рый позволяют выявленные нуклеотидные различия.
5.7.4 Идентифицированным биологическим видом считают вид, чья последовательность нуклео
тидов в базе данных максимально близка к полученной последовательности нуклеотидов и определя
ется как участок контрольного региона мтДНК рыб семейств Осетровые и Веслоносые. Идентичность /
вычисляют по формуле
где N — общее число выровненных позиций двух последовательностей нуклеотидов;
Примечание — Пример результата сопоставления полученной последовательности с последовательно
стью в базе данных приведен в приложении Д.
5.7.5Результаты идентификации икры рыб молекулярно-генетическим методом представляют в
виде заключения по образцу, приведенному в приложении Е.
5.8 Контроль качества испытаний
5.8.1 Для оценки качества секвенирования, поиска причин и путей устранения проблем рекомен
дуется использовать таблицы устранения проблем, приведенные в описании и документации к исполь
зуемому генетическому анализатору.
5.8.2 Корректность чтения нуклеотидов проверяют дополнительно вручную в целях исключения
ошибки автоматического анализа. Исключают из анализа плохо читаемые из-за всплесков фона нукле
отиды в начале и конце хроматограммы.
(
1
)
п — число несовпадающих оснований в выровненных позициях двух последовательностей нукле-
отидов.
13