ГОСТ 30812—2021
5.5.2 Отбор проб
5.5.2.1 Пробы отбирают и регистрируют по 4.4.2.
5.5.2.2 В том случае, если процесс лизиса анализируемой пробы с последующим выделением
ДНК будет начат не ранее чем через 1 ч от момента отбора проб, пробу в количестве от 2 до 3 г поме
щают в отдельную пробирку вместимостью 50 см3и фиксируют десятикратным объемом 96 %-ного рас
твора этилового спирта. Объемное соотношение пробы и раствора этилового спирта для сохранения
ДНК должно быть не менее 1:10.
Пробы хранят в растворе этилового спирта при комнатной температуре не более 30 сут, в моро
зильной камере при температуре не выше минус 16 °С не более 36 мес.
5.5.2.3 На всех этапах отбора проб должны быть обеспечены условия, предотвращающие конта
минацию, изменение состава и состояния отобранных проб. Пробы могут быть доставлены в лаборато
рию в мороженом виде после фиксации раствором этилового спирта концентрацией 96 % объемом, не
менее чем в пять раз превышающем объем фиксируемой пробы.
5.5.2.4 Не допускается попадание смеси Буэна или формальдегида в емкость с раствором эти
лового спирта для фиксации пробы, направляемой на молекулярно-генетический анализ. Пробы, всту
пившие в соприкосновение со смесью Буэна или формальдегида, считаются непригодными для моле
кулярно-генетического анализа.
5.5.3 Выделение ДНК
Для целей видовой идентификации зернистой икры используют интактную икринку. В случае ис
следования паюсной и ястычной икры объем отбираемых икринок увеличивают в два-три раза.
5.5.3.1 Для выделения ДНК из образца отбирают пробу массой (объемом), рекомендованной(ым)
в инструкции, прилагаемой к набору для выделения ДНК. Если материала достаточно, рекомендуется
параллельно подготовить два образца. Перед выделением ДНК необходимо удалить фиксирующий
раствор (спирт может быть удален фильтровальной бумагой или салфеткой).
5.5.3.2 Анализируемую пробу помещают в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью
1,5 см3 и добавляют буфер для лизиса из набора для выделения геномной ДНК. Пробирку помещают в
термостат для инкубации при температуре и на срок, указанные в инструкции к примененному
набору для экстракции и очистки ДНК.
5.5.3.3 Дальнейшие этапы выделения ДНК из анализируемой пробы проводят согласно инструк
ции к примененному набору для выделения ДНК.
5.5.3.4 Фильтрат, колонки и пробирки, подлежащие удалению, помещают в контейнеры для сброса
наконечников и использованных пробирок, герметично закрывают и утилизируют.
5.5.3.5 Выделенный препарат ДНК используют для постановки ПЦР
Допускается хранение препарата ДНК при температуре от 2 °С до 8 °С сроком не более 2 нед или
при температуре не выше минус 18 °С в течение 12 мес.
5.6 Проведение идентификации
5.6.1 Амплификация контрольного региона мтДНК
5.6.1.1 В пробирку для ПЦР вместимостью 0,2 см3 в качестве матрицы для амплификации ДНК
вносят 1 мм3 препарата по 5.5.3. Добавляют 24 мм3 реакционной смеси для ПЦР по 5.5.1.3.
5.6.1.2 Аналогичным способом готовят пробирки для ПЦР с Кв, К+ и К-.
5.6.1.3 Пробирки со смесью по 5.6.1.1 и 5.6.1.2 помещают в амплификатор с нагреваемой крыш
кой (температура крышки — 110 °С постоянно).
ПЦР проводят по следующей схеме:
а) предварительная денатурация ДНК — при температуре 95 °С в течение 2 мин;
б) синтез ПЦР-продуктов (35 циклов):
1) денатурация ДНК — при температуре 95 °С в течение 10 с,
2) отжиг праймеров — при температуре 54 °С в течение 30 с,
3) синтез цепи ДНК — при температуре 72 °С в течение 60 с;
в) окончательная достройка цепей — при температуре 72 °С в течение 5 мин;
г) охлаждение — при температуре 12 °С постоянно.
Примечание — Допускается хранение ПЦР-продукта в закрытой микропробирке при температуре от
2 °С до 8 °С сроком не более 2 нед или при температуре не выше минус 18 °С в течение более длительного срока.
5.6.1.4 Результат амплификации проверяют методом электрофореза в агарозном геле, приготов
ленном по 5.5.1.2.
11