ГОСТ 30812—2021
5.6.2 Детекция ПЦР-продукта
5.6.2.1 Камеру для электрофореза размещают на столе, устанавливают в строго горизонтальном
положении и производят заливку агарозного геля с последующим заполнением камеры 1-кратным элек
тродным буфером ТАЕ по 5.5.1.1 согласно инструкции по использованию камеры для горизонтального
электрофореза.
5.6.2.2 В камеру для электрофореза заливают готовый 1-кратный электродный буфер ТАЕ по
5.5.1.1 таким образом, чтобы жидкость покрывала гелевую пластинку.
5.6.2.3 Из пробирки с продуктом амплификации по 5.6.1 отбирают дозатором 5 мм3 анализиру
емой пробы, смешивают с 2 мм3 буфера для нанесения (концентрированная краска, которая входит
в набор с маркером молекулярных масс ДНК) и вносят в лунки агарозного геля, покрытые 1-кратным
электродным буфером. Для каждого отдельного образца используют отдельную лунку. В отдельную
свободную лунку в ряду лунок с образцами обязательно должен быть нанесен маркер молекулярных
масс ДНК.
5.6.2.4 Камеру подключают к источнику тока, соблюдая полярность. Электрофорез проводят при
напряжении и в течение определенного времени согласно рекомендациям в инструкции к использова
нию камеры для горизонтального электрофореза.
5.6.2.5 По завершении электрофореза выключают источник тока, переносят гель на экран вклю
ченного трансиллюминатора. Получают изображение агарозного геля с помощью видеосистемы реги
страции и передачи изображения флуоресцирующей ДНК в электрофорезных гелях.
5.6.3 Учет результатов ПЦР
5.6.3.1 На электрофореграмме качественно (визуально) определяют наличие или отсутствие
специфической полосы амплифицированной ДНК размером около 1000 п.н. Точная длина амплифици-
рованного специфического фрагмента ДНК зависит от вида объекта испытаний и может варьироваться в
пределах нескольких десятков нуклеотидов. При этом не должно наблюдаться дополнительных по лос,
за исключением возможных димеров праймеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.
5.6.3.2 Если результаты анализа положительных и отрицательных контролей не соответствуют
5.6.3.1, испытание повторяют начиная со следующих этапов:
- если в дорожках Кв и/или К- выявляется специфическая полоса, следовательно произошла кон
таминация реактивов или проб. Принимают меры по выявлению источника контаминации. Повторяют
испытание с этапа выделения ДНК (5.5.3);
- если в дорожке К+ не выявляется специфическая полоса, повторяют испытание с этапа ампли
фикации ДНК (5.6.1);
- если в дорожках наблюдаются неспецифические полосы на разных уровнях, то испытание повто
ряют с этапа ПЦР. Возможная причина неспецифической амплификации — неверный температурный
режим в ячейках амплификатора;
- если после повторной амплификации ДНК результаты ПЦР не соответствуют 5.6.3.1, испытание
повторяют начиная с этапа 5.5.3, заменяя все реактивы на новые. Возможная причина неудовлетвори
тельного результата — ухудшение свойств исходных компонентов реактивов.
5.6.3.3 Если результаты амплификации контролей не противоречат ожидаемому результату, пере
ходят к дальнейшим испытаниям.
5.6.3.4 В том случае, если после повторной амплификации отсутствует полоса в анализируемом
образце, но присутствует в К+ (положительным контрольным образце), образец признают непригодным
для дальнейшего анализа. Возможная причина неудовлетворительного результата — фатальное разру
шение (деградация) мтДНК вследствие неудовлетворительных условий хранения (фиксации) образца.
5.6.4 Реакция секвенирования продукта амплификации
5.6.4.1 Перед секвенированием амплифицированного фрагмента ДНК проводят очистку ПЦР-
продукта от невключившихся компонентов реакции.
В предварительно подготовленную колонку типа Centri-Sep наносят образец, полученный по 5.6.1
в полном количестве, после чего центрифугируют при рекомендованной скорости.
5.6.4.2 Для проведения реакции секвенирования ДНК по Сэнгеру в пробирку для ПЦР вместимо
стью 0,2 см3 вносят 4 мм3 препарата с очищенным образцом по 5.6.4.1.
5.6.4.3 Пробирки ставят в амплификатор с термостатируемой крышкой (температура крышки —
110 °С постоянно) и запускают программу амплификации по следующей схеме:
а) предварительная денатурация ДНК — при температуре 95 °С в течение 2 мин;
12