ГОСТ
Р 52723— 2007
7.4.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного контрольного образца вносят 5 мкл К-.
Затем в микропробирки с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени)добавляют по 5 мкл экстракта ДНК
каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очеродь в микропробирку с
ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+. Содержимое пробирок раство
ряют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-встряхивателе. После этого собирают осаждени
ем ПЦР-смось со стенок пробирок путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение
3— 5 с.
7.4.4 Если конструкция используемой модели амплификатора требует проведения ПЦР в специаль
ных пробирках-контейнерах, то полученное после растворения и перемешивания содержимое пробирок
для амплификации полностью переносят в такие контейнеры.
7.4.5 Плотно закрытые микролробирки центрифугируют 5— 7 с на микроцентрифуге-встряхивателе
при 2000 об/мин и помещают вамплификатор для проведения ПЦР по программе, указанной в таблице 5.
Т а б л и ц а б — Программа амплификации (качественного определения) фрагментов видоспецифичной ДНК
животных (крупного рогатого скота, свиньи) в режиме реального времени
Этап программы
Режим амплификации
ПроцессЧисло циклоп
Температура. ’СВремя, с
194180Денатурация ДНК1
9420Денатурация ДНК
2
6060*Отжиг праймеров
45
и синтез ДНК
* Включение оптики для детекции ПЦР-продуктое (в реальном времени): канал для красителей FAM.
7.4.6Проводятдетекцию продуктов ПЦР в соответствии с описанием к используемой модели ампли
фикатора (для проведения ПЦР сдетекцией в режиме реального времени).
8Детекция (обнаружение) продуктов амплификации
8.1 Детекция продуктов амплификации фрагментов видоспоцифичной ДНК растений и жи
вотных методом электрофореза11
8.1.1 Детекцию продуктов амплификации проводят при помощи метода электрофореза в агарозном
геле, реагенты для проведения которого собраны в специальный набор [18].
8.1.2 Содержимое пакета с надписью «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную
колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в 600 — 800 см3дистиллированной воды и доводят объем
полученного раствора до 1000 см3дистиллированной водой. Буфер хранят в течение года при комнатной
температуре.
8.1.3 Подготовку к работе прибора для горизонтального электрофореза проводят в соответствии с
прилагаемым к нему техническим описанием.
8.1.3.1 Размещают прибор на столе и с помощью регулируемых по высоте ножек, ориентируясь по
уровням, устанавливают прибор в фиксированное, строго горизонтальное положение.
8.1.3.2 Собирают кювету для заливки геля и устанавливают в нее 1— 4 гребенки (в зависимости от
количества анализируемых проб) так. чтобы расстояние между зубцами соседних гребенок и одной из
стенок кюветы составляло не менее 2 см.
8.1.4 Содержимое одного из пакетов с надписью «Агароза» полностью переносят в коническую тер
мостойкую стеклянную колбу вместимостью 250 см3, добавляют 150 см3 готового раствора буфера по
8.1.2 (концентрация геля — 1.5%). Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в СВЧ-печи (при
сред ней мощности), периодически помешивая, и продолжают нагреватьдо совершенно прозрачного
состояния (1 мин).
8.1.5 Агарозу охлаждаютдо температуры от 55 °С до 60 еС, добавляют 10 мкл раствора бромистого
этидия. аккуратно перемешивают, а затем наливают в кювету для геля прибора для электрофореза, не
11 Детекцию данным методом проводят в случав анализа по 7.1. 7.2.
229
11