ГОСТ Р 52723—2007
6.2 Выделение ДНК сорбентным методом с помощью набора реагентов
6.2.1 В пробирку с подготовленной по 5.3 пробой вносят 400 мкл ЛБ (в случае кристаллизации перед
использованием его необходимо подогреть втермостате при температуре от 50 “С до 60 °С и перемешать до
полного растворения осадка), гомогенизируют пробу с помощью микрогомогенизатора с целью допол
нительного измельчения пробы и наиболее полного смачивания ее ЛБ.
6.2.2 Пробуинкубируютвтермостате30 минпритемпературе 65 °С. послечегопередаютее наэтап
выделенияДНК.
6.2.3 Содержимое пробирки поремешивают на микроцентрифуге-встряхивателе. В случае, когда со
держимое пробирки затвердело во время инкубации в термостате, в эту же пробирку добавляют 300 мкл
(при необходимости до 1000 мкл) ЛБ и тщательно перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе. За
тем пробу центрифугируют на высокоскоростной центрифуге 10 мин при 8000 об/мин.
6.2.4 Надосадочную жидкость полностью отбирают с помощью автоматического дозатора, не заде
вая осадка, и переносят в чистую микропробирку вместимостью 1.5 см3,меняя наконечники при переходе
от пробы к пробе.
6.2.5 Добавляют к надосадочной жидкости 40 мкл суспензии сорбента. Перед использованием сор
бент перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе до получения однородной суспензии. Далее со
держимое микропробирки перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе и инкубируют при комнатной
температуре 7— 10 мин. периодически перемешивая содержимое путем переворачивания плотно закрытой
пробирки 2-3 раза. Затем содержимое микропробирки центрифугируют на высокоскоростной центрифуге
10 с при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость полностью удаляют при помощи автоматического
дозатора.
6.2.6 К осадку добавляют 500 мкл рабочего раствора ОБ 1. содержимое пробирки сначала переме
шивают на микроцентрифуге-встряхивателе до получения однородной суспензии, а затем центрифугируют
20 с при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора.
6.2.7 К осадку прибавляют 500 мкл рабочего раствора ОБ 2. содержимое микропробирки сначала
перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателедо получения однородной суспензии, а затем центри
фугируют 20 с при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора.
6.2.8 Повторяютоперации, изложенные в 6.2.6. В последний раз надосадочную жидкость удаляют
как можно более полно, не задевая приэтом осадка.
6.2.9 Микропробирку открывают, осадок сушат в термостате 5— 7 мин при температуре 65 °С. К высу
шенномуосадкудобавляют 75 мкл ТЕ-буфера, перемешивают содержимое микропробирки на микроцент
рифуге-встряхивателе до получения однородной суспензии и термостатируют 10 мин при температуре 65
°С. (Если суспензия сразу не образовалась, микропробирку помещают в термостат на 2—3 мин. после чего
вновь перемешивают).
6.2.10 Содержимое микропробирки повторно перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе и цен
трифугируют на высокоскоростной центрифуге втечение 2 мин при 10000 об/мин.
6.2.11 Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) переносят в чистую микропробирку, не задевая при
этом осадка, поскольку попадание в нее сорбента может вдальнейшем приводить к ингибированию ПЦР
6.2.12 Полученный экстракт ДНК передают на этап проведения амплификации и при необходимости
хранят при температуре 4 вС в течение 1 мес или при температуре минус 18 °С до 1 года.
6.2.13 В чистую микропробирку отбирают 30— 80 мкл ТЕ-буфера и передают на этап проведения
амплификациидля постановки контролей амплификации.
7 Амплификация фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных
Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных используют наборы реаген
тов для ПЦР. содержащие праймеры, специфичные к ДНК определенного вида растений или животных.
При проведении анализа в ПЦР-лаборатории соблюдают меры предосторожности всоответствии с прило
жением А.
7.1 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных с
использованием наборов реагентов для ПЦР с жидкими праймерами
7.1
.1
В штативе размещают и маркируют необходимое число микропробирок с лиофильно высушен
ной амплификационной смесью по числу анализируемых проб, включая пробирки для положительного и
отрицательного контролей. В случае исследования многокомпонентных продуктов число микропробирок
на одну пробу, а также число микропробирокдля отрицательных и положительных контрольных образцов
рассчитывается исходя из того, какое число видовДНК планируется идентифицировать.
2257