ГОСТ
Р 52723— 2007
7.2Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных с
использованием наборов реагентов для ПЦР с высушенными праймерами
7.2.1 В зависимости от количества анализируемых проб в штативе размещают и маркируют микро
пробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью, одну микропробирку с лиофильно высу
шенной амплификационной смесью К-. одну микропробирку с лиофильно высушенным содержимым К+. В
случае исследования многокомпонентных продуктов число микропробирок на одну пробу, а также число
микропробирокдля отрицательных и положительных контролой рассчитывают исходя из того, какое число
видовДНК планируется идентифицировать.
7.2.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью при помощи автоматического дозатора вносят 10 мкл
ПЦР-растворителя.
7.2.3 В микропробирку К- вносят 10 мкл ТЕ-буфера. подготовленного по 6.2.12. В микропробирки с
ПЦР-смесью добавляют по 10 мкл экстракта ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по
разделу 6. В последнюю очередь в микропробирку К+ вносят 10 мкл ТЕ-буфера. подготовленного по
6.2.12. Содержимое микропробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-
встряхивате-ле. После этого капли ПЦР-смеси собирают осаждением со стенок микропробирок путем
центрифугирова ния на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 3— 5 с.
7.2.4 Еслидля проведения амплификации используется амплификатор без нагреваемой крышки, то в
каждую микропробиркудобавляют по 20— 25 мкл (2 капли) минерального масла.
7.2.5 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют 5— 7 с на микроцентрифуге-встряхивателе
при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения ПЦР по программам, указанным в таблицах
1 и 2. По окончании действия программы микропробирки извлекают из амплификатора и в штативе переда ют
на этап детекции продуктов ПЦР.
7.3 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных
с использованием наборов реагонтов для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального
времени
7.3.1 В штативе размещают и маркируют необходимое количество микропробирок с лиофильно вы
сушенной амплификационной смесью (для ПЦР в реальном времени)по количествуанализируемых проб, а
также микропробирки для К- и К+. В случае исследования многокомпонентных продуктов число микро
пробирок на одну пробу, а также число микропробирок для К- и К+ рассчитывают исходя из того, какое
число видовДНК планируется идентифицировать.
7.3.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) при помощи автомати
ческого дозатора последовательно вносят и 10 мкл ПЦР-растворителя и 10 мкл смеси праймеров для
выявления конкретного фрагмента видоспецифичной ДНК того или иного компонента растительного или
животного происхождения. Перед использованием смесь праймеров размораживают в твердотельном тер
мостате сохлаждением при температуре 4 °С, перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе 5— 10с. а
затем собирают осаждением на дно микропробирки путем центрифугирования на микроцентрифуге-встря
хивателе 3— 5с. Последующую работу с праймерами рекомендуется проводить при температуре от 2
*С до 4 °С с использованием твердотельного термостата с охлаждением.
7.3.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для К- вносят 5 мкл ТЕ-буфера. подготовленного по 6.2.12.
Затем в микропробирки с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) добавляют по 5 мкл экстрактаДНК
каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь в микропробирку с
ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+. который входит в состав набора
реагентов. Содержимое пробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-встряхи
вателе. После этого собирают осаждением капли ПЦР-смеси со стенок пробирок путем центрифугирования
на микроцентрифуге-встряхивателе втечение 3— 5 с.
7.3.4 Если конструкция используемой модели амплификатора требует проведения ПЦР в специаль
ных пробирках-контейнерах, то полученное после растворония и перемешивания содержимое пробирок
для амплификации полностью переносят втакие контейнеры.
7.3.5 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют 5— 7 с на микроцентрифуге-встряхивателе
при 2000 об/мин и помещают в амплификатордля проведения амплификации по программам, указанным в
таблицах 3 и 4.
227
9