ГОСТ Р 51758-2001
.
(второй пассаж). Снова проводят ежесуточные наблюдения под микроскопом за состоянием моно
слоя и через 1—2 сут посте формирования нового монослоя клетки снимают и пересевают. Так
повторяют еще два раза (всего пять пассажей).
Из каждого пассажа отбирают пробу снятых клеток и ресуспендируют в объеме среды, равном
>/,„ объема сосуда. Смешивают 1см
3
полуденной суспензии cl см
3
красителя (раствора трипановой
сини или кристалл-виолета), смесью заполняют камеру Горяева и подсчитывают в ней количество
клеток.
6.3.3 Обработка результатов
6.3.3.1 Для каждого пассажа вычисляют количество снятых клеток в 1см
3
суспензии, умножая
подсчитанное количество клеток на коэффициент
1111
6.3.3.2 Дчя каждого пассажа вычисляют индекс пролиферации по 6.2.4.1.
6.3.3.3 Оценка результатов
По ростовым свойствам среду оценивают как нетоксичную, если в каждом пассаже она
обеспечивает формирование монослоя клеток через 3—4 сут после посева, имеет индекс пролифе
рации не ниже 2,0 —4.0 (в зависимости от линии клеток) при условии, что клетки на протяжении
всего срока культивирования сохраняют типичные, без дегенеративных изменений, черты линии в
соответствии с каталогом |2|. В противном случае и при отсутствии тех же признаков токсичности
контрольной среды испытуемая выбраковывается. Если контрольная среда проявляет признаки
токсичности, оценивание испытуемой среды повторяют с новой контрольной пробой.
6.4 Метод определения ростовых свойств белковых гидролизатов для клеточных линий
Сущность метода заключается в приготовлении питательных сред с разным содержанием
испытуемых гидролизатов в солевом растворе, высеве на полуденные питательные среды культуры
линии клеток, оценке состояния культуры (образование монослоя, наличие или отсутствие деструк
ции) на третьи и седьмые сутки инкубирования и определении оптимальной концентрации гидро
лизата в среде.
6.4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы по
6
.1.1 и 6.3.1.
Линии клеток IIП. ПК, ПТ или другие, адаптированные к росту на испытуемой среде.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104. наибольшим пределом взвешивания
I кг, 3-го класса точности.
6.4.2 Подготовка к испытанию
6.4.2.1 Подготовка питательных сред из гидролизата
Испытуемый сухой гидролизат растворяют в солевом растворе Хепкса израсчета 0,5 гна 100 см
3
раствора. Получают исходный концентрат массовой долей гидролизата 0.500 %. Готовят три разве
дения концентрата, добавляя к одному объему концентрата один, три и семь объемов раствора
Хенкса. Массовые доли гидролизата в разведениях состаатяют 0,250; 0,125 и 0,062 % соответственно.
Полуденные среды (концентрат и его разведения) переносят в стерильные флаконы вместимостью
500 см
3
и добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатого скота объемом 5 % объема среды.
Среды во флаконах проверяют на стерильность по ГОСТ 28085. Для дальнейших испытаний
используют только стерильные пробы.
6.4.2.2 Подготовка суспензии клеток
Культуру клеток реактивируют пересевом на проверенный образец среды, аналогичный испы
туемой. в четырех культуральных сосудах. Культуру клеток снимают раствором версена, подогретым
до 35 —37 *С, объем которого составляет 3 —5 % вместимости сосудов. Сосуды с растворами
оставляют при комнатной температуре на 5 —20 мин до появления в монослое «окон* (начало
отделения ктеток от стекта). Затем основную массу растворов осторожно сливают, оставляя по 3 —7
см3, культуральные сосуды (матрасы) переворачивают вниз монослоем и культуру дополнительно
выдерживают до потного отделения ктеток от сгекла. В матрасы вносят питательные среды (исходный
концентрат и три разведения) по 6.4.2.1объемами 3 —5 % их вместимости, энергично встряхивают и
отбирают пробы для подсчета общего количества клеток в камере Горяева по
6
.1.2.2.
Суспензии разводят соответствующей питательной средой до получения количества ктеток в
I см
3
80 — 100 тыс/см3. Объем питательной среды рассчитывают с учетом показателя разведения
(отношение количества ктеток в исходной и разведенной суспензии).
6.4.3 Проведение испытания
Суспензии клеток, приготовленные по 6.4.2. вносят в 20 культуральных сосудов (по 5 на каждое
разведение гидролизата), заполняя их на ‘/ю вместимости. Сосуды с суспензиями ктеток помешают
в термостат при (36 ± 1) "С и просматривают пробы под микроскопом на 3 и 7 сут инкубирования,
наблюдая рост монослоя и наличие или отсутствие его деструкции. Одновременно определяют
17