ГОСТ Р 51758-2001
6.2 Метод определения токсичности питательных сред для первичных культур клеток
Сущность метода состоит в приготовлении концентрированной суспензии первичной культуры
клеток фибропластов перепелиных или куриных эмбрионов, посеве приготовленных суспензий на
испытуемую и контрольную среды, микроскопическом наблюдении за посевами с целью определе
ния времени образования монослоя, индекса пролиферации, признаков деструкции монослоя и
наличия дегенеративных изменений клеток.
6
.
2.1
Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы —по 6.1.1.
6.2.2 Подготовка к испытанию
Подготовка к испытанию —по 6.1.2.
6.2.3 Проведение испытания
В четыре пробирки с испытуемой и четыре пробирки с контрольной средой вносят по I см
3
суспензии клеток с посевным количеством клеток 0.6 млн, приготовленной по
6
.1.2.1. Затем еже
дневно в течение 7 сут проводят микроскопию двух пробирочных культур в каждой среде с целью
определения времени образования монослоя; через 7 сут роста монослоя оценивают наличие или
отсутствие деструкции монослоя и дегенеративных изменений клеток в сравнении с каталогом |
2
|.
Из двух других пробирок с клеточной культурой в каждой среде через 24 ч посте образования
моностоя удаляют питательную среду, вносят в пробирки по I см
3
раствора версена (для снятия
клеток) и инкубируют при (37,0 ± 0,5) ’С в течение 15 —20 мин.
Затем трижды подсчитывают общее количество снятых клеток в 1 см
3
каждой суспензии по
6
.1.2.2. За результат испытания каждой суспензии принимают среднее арифметическое результатов
шести определений.
6.2.4 Обработка результатов
6.2.4.1 Определение индекса пролиферации
Индекс пролиферации Хь вычисляют по формуле
где Л —общее количество выросших клеток в
1
см
5
снятой суспензии, тыс/см3;
В —количество посаженных клеток в I см
3
посевной суспензии, тыс/см3.
6.2.4.2 Оценка результатов
Среды считают нетоксичными, если они обеспечивают образование монослойной культуры в
те же сроки, что и контрольные —не позже 48 ч, без признаков деструкции монослоя идегенерации
клеток в культуре через 7 сут и с индексом пролиферации не менее 0.5. При появлении дегенера
тивных изменений клеток в культуре и снижении количества выросших клеток более чем на 30 %
по сравнению с контрольной средой питательную среду выбраковывают как токсичную.
6.3 Метод определения ростовых свойств питательных сред для клеточных линий
Сущность метода заключается в посеве тест-культур клеточных линий па испытуемую и
контрольную среды, пересевах после образования монослоя на свежие порции питательных сред и
определении времени формирования монослоя, индекса пролиферации, наличия или отсутствия
дегенерации тест-культуры и деструкции мопослоя.
6.3.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы по
6
.1.1.
Среда питательная 199, среда Игла, среда Игла МЕМ или другие, предварительно тестирован
ные в качестве контрольных.
Линии клеточные гетероплоидные: ВНК-21; VERO: СПЭВ, ЛЭК, ТЭБ или другие, адаптиро
ванные к испытуемой среде.
Линии клеточныедиплоидные: 4647; М-22, ЛЭЧ-240илидругие,адаптированные к испытуемой
среде.
6.3.2 Проведение испытания
Вдвакультуральныхсосуда вносятиспытуемуюи контрольнуюсредыобъемом •/,„ ихвместимости,
добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатогоскота от
2
до
10
%объема среды и определенное
количество клеток (посевную дозу) тест-линий (
10
—
100
тыс/см
1
в зависимости от линии клеток),
определенное по 6.1.2. Клетки культивируют при (37,0 ± 0.5) *С. Ежесуточно проводят наблюдения за
развитием монослоя микроскопией посевов иопределяют времяобразования моностоя исостояние клеток
(наличие или отсутствие дегенеративных изменений клеток) в сравнении с |
2
|.
Через 1—2сут после формирования монослоя клетки снимают раствором версена или трипсина
и пересевают в новые культуральные сосуды со свежими порциями испытуемой и контрольной сред
16