ГОСТ I»51758-2001
инкубируют при (37,0 ± 0,5) "С от 9 до 10 сут. Яйца с хорошо развитыми подвижными эмбрионами
помещают в металлические лотки нугой вверх и двукратно погружают в раствор йодистого калия. В
боксе поверхность яиц фламбируют и вскрывают по окружности пути глазными ножницами.
Сте рильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают хорионаллантоисную оболочку и
извлекают эмбрион в чашку Петри. У эмбриона удаляют голову и внутренние органы. Тушку
измельчают ножницами на фрагменты длиной не менее 0,5 мм, помешают во флаконы,
добавляют раствор Хенкса температурой от 18 до 25 *С и объемом, равным двух-, трехкратному
объему измельченной ткани. После отстаивания смеси надосадочную жидкость сливают. В
суспензию вносят такой же объем свежей порции раствора Хенкса и после отстаивания
надосадочную жидкость также сливают. Промывают ткань три-четыре раза до полного осветления
иадосадочной жидкости.
Во флаконы с измельченной тканью добавляют раствор трипсина температурой 37 ’С: три объема
на один объем ткани. Флаконы выдерживают притемпературе от 18 до 25 *С от 30до 45 мин, постоянно
перемешивая их содержимое. Надосадочную жидкость сливают. К осадку добавляют сыворотку крови
крупного рогатого скота объемом 5 % от объема осадка. Суспензию центрифугируют 10 мин при частоте
вращения 1000 м и н 1. Надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют два —четыре объема
расттюра Хенкса. осадок ресуспендируют и получают концентрированную суспензию.
6
.1.2.2 Подсчет количества клеток в концентрированной суспензии
Отбирают пробу суспензии и разводят ее в 10 раз: к одному объему концентрированной
суспензии (0,3 —0,5 см’) добавляют девять объемов раствора Хенкса (2,7 —4,5 см3). К 2—3 см
3
поду
ченной суспензии добаатяют равный объем раствора трипановой сини и перемешивают. Каплю кле
точной суспензии помещают на край покровного стекла так. чтобы она заполнила камеру Горяева.
По всей камере под микроскопом подсчитывают общее количество клеток (окрашенных и
неокрашенных) и количество жизнеспособных (неокрашенных). Конгломераты считают за одну
клетку. Подсчет проводят трижды и за результат принимают среднее арифметическое результатов
определений, полученных для общего количества клеток и количества жизнеспособных клеток в
камере.
Количество жизнеспособных клеток в I см* концентрированной суспензии А’,, тыс/см3, вы
числяют по формуле
= АВ 1000
0,9
(4)
где А —среднее арифметическое результатов определений количества жизнеспособных клеток,
клетки;
В —показатель разведения суспензии растворами Хенкса и трипановой сини;
0,9 —объем камеры Горяева, мм3;
1000
—коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.
Общее количество клеток в 1см* суспензии А,, тыс/см3, вычисляют по формуле
у
п о
л-»
_ СВ 1000
(5)
где С —среднее арифметическое результатов определений общего количества клеток, клетки;
Остальные величины —по формуле 4.
6
.1.2.3 Приготовление контрольных питательных сред из стандартных образцов
Стандартные образцы питательных сред ССО-ГЛА или ССО-ФГМС растворяют в 400 см
3
стерильной деминерализованной воды электропроводностью не более 0,5 мкСим во флаконах вмес
тимостью 500 см3. Флаконы закрывают резиновыми пробками. Растворы хранят не более 2 мес при
температуре от
6
до 10 *С.
Перед использованием растворов ССО в качестве контрольных сред корректируют pH до 7.0
—7,4 добавлением раствора кислого углекислого натрия (около 3 см3).
6.1.3 Проведение испытания
Исходную концентрированную суспензию клеток разбавляют исследуемой или контрольной
средой для получения рабочих суспензий, содержащих
0.6
млн жизнеспособных клеток в
1
см
3
суспензий в соответствии с таблицей 4. Для этого во флаконы с исследуемой и контрольной средами
предварительно вносят референс-сыворотку объемом
2
% объема среды.
Затем в два стерильных культуральных сосуда наливают из флаконов указанные в таблице 4
объемы исходной суспензии и доливают до общего объема
20
см1: первый сосуд —исследуемой
средой, второй —контрольной средой. Получают две рабочие суспензии.
14