ГОСТ Р 51758-2001
4.4.1.2 Подготовка к испытанию
4.4.1.2.1 Приготовление реактивов для окраски по Граму (модификация Г.П. Калины)
Приготовление реактива 1
В 100 см’ этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.
Приготовление реактива 2
5 г йодистого калия растворяют в 1дм’ спирта в водяной бане при температуре (45±5) ‘С при
постоянном перемешивании.
К % см’ спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 см’ спиртовою раствора основного
фуксина и
2
см’ спиртового раствора йода.
4.4.1.2.2 Подготовка питательных сред и культур тест-штаммов
Подготовка питательных сред и культур тест-штаммов —по 4.1.1.2.
4.4.1.3 Проведение испытания
В пробирки или чашки Петри с испытуемой и контрольной (МПБ или МПА) питательными
средами вносят по 0,2 см’ 20 —24-часовы.х культур тест-штаммов и инкубируют от 20 до 24 ч при
температуре (37±!) *С. Из полученных культур на испытуемой и контрольной средах отбирают пробы
для пересева на свежие порции питательных сред (второй пассаж). Аналогично делают еще один
— три пересева 20 —24-часовых культур на свежие порции питательных сред (всего три —пять
пасса жей).
Из каждого пассажа на два чистых предметных стекла бактериальной петлей наносят по капле
дистиллированной воды, вносят в нее петлей небольшое количество микробной культуры тсст-штам-
ма в испытуемой и контрольной среде и каплю реактива 1. Смесь распределяют петлей на участке
площадью примерно I см’.
Приготовленный мазок препарата подсушивают на воздухе, после чего фиксируют: быстро
проводят два-три раза над верхней частью пламени горелки.
Препарат промывают питьевой водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.
После просушивания на препарат наливают реактив 2 так, чтобы жидкость покрыла всю
поверхность стекла, и выдерживают 0,5 —I мин. Раствор сливают. Предметное стекло ополаскивают
проточной водой. Препарат просушивают фильтровальной бумагой.
Мазки просматривают под микроскопом с иммерсионной системой.
В результате окрашивания микроорганизмы, красящиеся по Граму (грамположительные),
приобретают темно-фиолетовый цвет; не красящиеся по Граму (грамотрнцательные) —ярко-мали
новый или красный цвет.
При микроскопии мазководновременно оценивают морфологию клеток:
- размеры;
- форму: прямая (палочки), круглая и овоидпая (кокки), изогнутая, спиральная, ветвящаяся,
лентовидная, веретеновидная и т. д.;
- наличие спор, жгутиков;
- расположение в мазке (одиночное, парами, короткими илидлинными цепочками, тетрадами,
скоплениями, нитями и т. д.
4.4.1.4 Оценка результатов
Морфология клеток тест-штаммов и отношение к окраске по Граму должны соответствовать
характеристике по таблице 3, что свидетельствует об отсутствии влияния питательной среды на
типичность микроорганизмов. При несоответствии морфологии клеток и окраски по Граму
требованиям таблицы 3 в двух пассажах из пяти (или в одном из трех) испытание дважды
повторяют с новыми пробами испытуемой питательной среды и при повторении несоответствия
среду бракуют.
При несоответствии морфологии клеток тест-штамма и характера окраски по Граму в кон
трольной среде опыт дважды повторяют с новыми пробами контрольной питательной среды. При
несоответствии тех же свойств тест-штамма свойствам таблицы 3 в двух повторных определениях
меняют исходную культуру тест-штамма как несоответствующую своему виду и типу.
4.4.2Метод определения влияния питательной среды на формы роста тест-штаммов в пита
тельных средах
Сущность метода заключается в посеве реактивированной микробной культуры тест-штам
ма в испытуемую жидкую или на плотную питательную среду, инкубировании посевов, трех-,
пятикратных пересевах культуры на свежие порции той же питательной среды, визуальном
просмотре выросших культур в жидких питательных средах, визуальном или при малом увели
чении просмотре колоний —на плотных питательных средах и оценке форм их роста в
соответ ствии с таблицей 3.
9