rOCTISO/TS 13136—2016
BPW применяют для анализа проб, которые предположительно содержат подвергнутые стрессу
целевые бактерии (например, пробы замороженных продуктов), чтобы реанимировать подвергнутые
стрессу бактерии STEC. и предположительно содержащие меньшее количество нецелевых микроорга
низмов, чем свежие пробы.
П р и м е ч а н и е — Добавление новобиоиина является спорным и было исследовано несколькими авто
рами. Было установлено, что минимальная ингибирующая концентрация антибиотика для бактерий STEC, не от
носящихся к серогруппе 0157. ниже, чем для штаммов серогруппы 0157 (см. [5]). Добавление новобиоцина при
обогащении в mTSB, когда концентрация новобиоцина является типичной (20 мг/дм3), как это установлено в
[19], приводило к подавлению роста приблизительно одной трети клеток штаммов бактерий, не относящихся к
сврсгруп-пе 0157 (см. [6]), что повышает риск ложно-отрицательных результатов.
4.3 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)
Нуклеиновые кислоты экстрагируют в соответствии с требованиями используемой системой ПЦР
в режиме реального времени.
4.4 Выявление целевых генов
Очищенную ДНК используют для обнаружения следующих целевых генов:
- основные гены вирулентности для STEC: генов
stx.
кодирующих токсины Шига и еае-гена, коди
рующего белок массой 90 еда — интимин, участвующих в механизме адгезии, которая является харак
терным признаком штаммов STEC, вызывающих тяжелые заболевания. Гены
stx
кодируют семейство
токсинов, в том числе два основных типа: s/x1 и
stx
2. S?x2 состоит из семи четко установленных вари
антов — от
stx
2а до
stx2g
(см. [22]). Варианты генов
stx2a. stx2b
и
stx2c,
присутствующие в штаммах
бактерий STEC, в числе генов, которые приведены в разделе 1, представляют собой целевые гены,
кодирующие Шига-токсин, на которые распространяется настоящий стандарт.
В базе данных GenBank генам, кодирующим данные варианты
stx2.
присвоены следующие обо
значения:
stx2a:
Х07865;
stx2b:
L11078:
stx2c:
М59432.
- ген
оав,
кодирующий интимин;
-гены для определения соответствующей серогруппы:
rfbE(
0157). wbo7(0111), tvzx(026),
/Лр1(0145) и ivzx(O103).
4.5 Выявление
Выявление целевых генов проводят в соответствии с требованиями используемой системы ПЦР
в режиме реального времени.
4.6 Селекция из положительных проб
Если есть подозрение, что в пробе присутствуют STEC. проводят селекцию микроорганизмов. В
случае обнаружения по меньшей мере одной серогруппы. которая описана в разделе 1. допускается
проводить обогащение данной серогруппы (например, методом иммуномагнитного разделения), после
чего проводят посев на агар с триптоном. желчью и глюкуроновой кислотой (ТВХ) или на определенную
селективную среду, если существует такая возможность (см. приложение F. примечания 2 и 3). Данную
операцию проводят с целью облегчения отделения STEC от фоновой микрофлоры.
5 Разбавители, питательные среды и реактивы
В ходе проведения анализа, если не указано иное, используют реактивы только признанной ана
литической степени чистоты и стерильную, дистиллированную, деминерализованную воду или воду
эквивалентной чистоты.
5.1 Питательные среды
5.1.1 М одиф ицированный триптон-соевы й бульон (mTSB)
5.1.1.1 Базовый состав и pH среды
Ферментативный перевар казеина — 17 г;
Ферментативный перевар сои — 3 г;
0(+)-глюкоза — 2.5 г;
Натрия хлорид — 5 г;
3