ГОСТ ISO/TS 13136—2016
9.2 Обогащение
9.2.1 Инкубирование
Содержимое мешка перистальтического смесителя, пробирки или флакона (см. 9.1.2) инкубируют
при температуре (37 ± 1) °С в течение 18— 24 ч.
9.2.2 Контроль над процессом (для ПЦР в реальном времени)
Контроль над процессом выполняют в соответствии с положениями, изложенными в ISO 22174.
Руководство по внутреннему контролю амплификации (IAC) и контролю над процессом приведе
ны в приложении D и С.3.8.
9.3 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)
Методики экстракции нуклеиновых кислот (ДНК) должны соответствовать методикам, применяе
мым в отношении грамотрицательных бактерий. Полный перечень методов приведен в (10). Кроме того,
допускается использовать имеющиеся в продаже наборы в соответствии с инструкциями
изготовителя.
9.4 ПЦР-амплификация (для ПЦР в режиме реального времени)
9.4.1 Общие положения
Используемый процесс ПЦР-амплификации применяют при проведении ПЦР в режиме реального
времени.
Необходимо выполнять все требования к ПЦР-амплификации. которые изложены в ISO 20838.
Информация о праймерах и зондах для обнаружения, использующихся при проведении ПЦР в
режиме реального времени, приведена в приложении Е.
9.4.2 Обнаружение продуктов ПЦР
Прибор для обнаружения продуктов ПЦР улавливает световое излучение, как только оно возни
кает в процессе амплификации.
9.4.3 Интерпретация результатов ПЦР-анализа
Результаты, полученные при проведении ПЦР. в том числе контрольные, информация о которых
приведена в ISO 22174 и в приложении D, обрабатывается программным обеспечением прибора для
амплификации. В ходе процесса амплификации программное обеспечение прибора контролирует ПЦР-
амплификацию с использованием 5‘-нуклеазы посредством анализа интенсивности флуоресценции ре-
портерного красителя для каждой пробы,
Rn. &Rn
— это разность
Rn
и контрольного значения интенсив
ности флуоресценции репортерного красителя, определенного в результате первых нескольких циклов.
Значение порогового цикла. С(, определяют как номер цикла, при котором значение интенсивности
флуоресценции A
Rn
данной пробы превышает установленное значение порогового цикла.
В случае, если были получены сомнительные результаты, проводят проверку кривых значений
излучения на графике. Для проб, демонстрирующих положительный результат, характерна кривая, на
которой явно выражено усиление флуоресценции, начиная с количества циклов, значения которых со
ответствуют Сг
Если полученные значения приводят к непредвиденным результатам, то анализ повторяют.
Данный метод является последовательным (см. блок-схему на рисунке А.1). Стадии данного ме
тода следующие:
- стадия 1: обнаружение генов, кодирующих Шига-токсин и гена, кодирующего интимин (см. ПЦР
А. приведено в приложении Е; данную процедуру можно также провести с помощью дуплексной ПЦР);
- стадия 2 а): проведение испытания проб, содержащих бактерии с генами
stx
и
еае
гена, на моле
кулярное серогруппирование (см. ПЦР Б. приведено в приложении Е);
- стадия 2 б): Выделение штаммов бактерий из проб, бактерии в которых содержат гены, кодиру
ющие Шига-токсин; допускается использовать метод обогащения конкретных серогрупп (например, им-
муномагнитное разделение) для повышения эффективности отделения клеток бактерий STEC от проб,
содержащих хотя бы одну из серогрупп, приведенных в разделе 1 (см. 9.5 и рисунок В.1).
9.5 Выделение штаммов
Выделение штаммов бактерий STEC необходимо для подтверждения того, что положительный
результат ПЦР-анализа получен из ДНК именно этих живых бактериальных клеток.
В случае наличия одного из генов, характерных для серогрупп, приведенных в разделе 1. допу
скается проведение обогащения конкретной серогруппы с целью повышения эффективности стадии
6