ГОСТ ISO/TS 13136—2016
Приложение D
(справочное)
Внутренний контроль амплификации
Три различных внутренних контроля элементов амплификации (lACs) могут быть использованы в ПЦР в
режиме реального времени:
- TaqMan®1) представляет собой внутренний положительный контроль. Это комплект реагентов, включаю
щий в себя все необходимые реагенты (праймеры. Vicn<4 IAC ДНК-мишень и стоп-раствор). IAC ДНК-мишень
требует разбавления в 10 раз. для достижения количества копий примерно для 100 ЛЦР-реакции. Размер образу
ющегося ПЦР продукта неизвестен.
- Использование формулы pUC 19 на основе внутреннего контроля амплификации IAC (27). Приблизительно
100 копий целевой ДНК (PUC 19) следует использовать в реакции ПЦР. Размер образующегося ПЦР продукта IAC
составляет 119 Ьр.
- Рекомбинантную плазмиду (имеющую название Piac-STEC) можно использовать в конкретных анализах
six
с помощью ПЦР в режиме реального времени. Этот элемент IAC содержит следующий ДНК-фрагмент, клонирован
ный в позицию EcoRI плазмиды pUC19:
5’ATTTTTGTTACTGTGACAGCTGAAGCTTTACGTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTAT
AGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAATT-3’ (жирным шрифтом выделены прямой и обратный s/x1/sfx2 прай
меры. связывающие сайты последовательности; подчеркнутая последовательность: IAC-зонд сайт связывания).
IAC может быть усилен генами
six,
используя те же праймеры, для
stx
генов (см. приложение Е), с теми
же условиями и в той же ПЦР-пробирке (14). Он обнаруживает специфическую ДНК в пробе (5* [Red640]-
CAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCG-[BHQ2) 3’). включенного в смесь ПЦР в концентрации, идентичной что и для
зондов ДНК генов sfx1 и
stx2
(как помечены [флюоресцином] и [BHQ1] на их 5’- и З’-концах соответственно). В об щей
сложности 64 копий IAC следует использовать в реакции ПЦР. Продукт ПЦР МАК96 парных оснований. Произ
водительность в результате stx-IAC ПЦР в режиме реального времени было показано с помощью искусственно и.
естественно загрязненных проб пищевых продуктов (см. (5)).
Вторая и третья системы также могут быть использованы в качестве контроля экстракции путем добавления
100 копий плазмиды pUC 19 или p!AC-STEC в пробу перед стадией очистки ДНК.
TaqMan и Vic являются торговыми наименованиями продукции, поставляемой Applied Biosyslems. Данная
информация приведена для удобства пользователей настоящим стандартом и не является рекламой ISO данной
продукции. Допускается применение аналогичных продуктов, если доказано, что они обеспечивают получение со
поставимых результатов.
16