rOCTISO/TS 13136—2016
В качестве отрицательного контроля следует использовать любой штамм
E.coti
К12, например. MG1655.
Контроли для ПЦР получают, как указано в С.3.2. Контроли могут быть подготовлены заранее и хранится в
аликвотах по 10 мм3, готовых к использованию при температуре минус 20 "С в течение 8 мес.
С.3.9 Интерпретация результатов
Пробы, показывающие фрагменты амплификации ожидаемого размера (см. С.3.4 и в таблице С.1). считают
ся положительными на наличие в своем геноме целевых генов.
Необходимо включать положительные и отрицательные контроли в каждой реакции, давая положительные
и отрицательные результаты, соответственно. Если контроли дают неоднозначные результаты, необходимо повто
рить всю процедуру анализа.
Проверка правильности ампликона с помощью прямого секвенирования или других подходящих способов
можно считать излишним, так как этот метод предназначен для подтверждения штаммов, выделенных и уже под
вергшихся ПЦР-анализу в режиме реального времени.
Подтверждение ампликонов (например, путем прямого секвенирования или путем анализа эндонуклеазы
рестрикции) необходимо проводить при получении неоднозначных результатов.
Т а б л и ц а С.1 — Олигонуклиотидкые праймеры, получаемые фрагменты ожидаемого размера
Целевой геи
Название
праймеров (СМ. (11))
Последовательность
праймеров
Размер
ампликонов,
Ьр
eaeAF
GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC
384
ООО
eaeAR
CCA CCT GCA GCAАСАAGA GG
s^x^F
АТА AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC
1
on
SJX1
stx
1R
AGAACG CCC ACT GAG АТС АТС
lo u
slx2
(группа)
stx2F
GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC
occ
stx2R
TCG CCA GTT АТС TGA CAT TCTG
ZOO
Параметры амплификации (см. [11]): 35 циклов ПЦР. каждый из которых включает 1 мин денатурации при
температуре 95 "С: 2 мин отжига при температуре 65 *С в течение первых 10 циклов, уменьшая температуру до 60
“С с 11 до 15 цикла (1 ’С за цикл) и 1.5 мин относительного удлинения при температуре 72 ’С. увеличивая до 2.5
мин с 25 до 35 цикла.
15