rOCTISO/TS 13136—2016
Приложение С
(справочное)
Идентификация
Escherichia coli,
продуцирующ их Ш ига-токсин (STEC), путем выявления генов
вирулентности мультиплексной ПЦР-амплификацией и обнаружение продуктов ПЦР путем
электрофореза в агарозном геле
С.1 Общие положения
STEC являются штаммами
Escherichia coli.
которые позволяют внедряться лизогенным бактериофагам, име
ющим гены, кодирующие синтез Шига-токсинов (см. J12)). Метод, описанный в настоящем приложении, позволяет
обнаружить с помощью мультиплексной ПЦР наличие STX-кодирующих генов в культурах
Е. coli,
принадлежащих к
STEC. Проводят также определение наличия гена еае, поскольку он присутствует в штаммах STEC. вызывающих
тяжелые заболевания человека.
Использование пар олигонуклеотидных праймеров sfx1F/s(x1f? и
slx2F/stx2R
(см. [11J), позволяет обнаружить
гены s*x1
и stx2
соответственно.
stx2F/stx2R
позволяет обнаружить все варианты гена
six
2. кроме
slx2f.
Тем не
менее, это не является существенным для здоровья населения, так как данный вид гена в основном присутствует
в STEC. выделенных из птиц (см. [20]). Праймеры, используемые для обнаружения гена еае (см. [11]), способны
распознавать все описанные в публикациях полиморфные варианты этого гена.
П р и м е ч а н и е — Метод, приведенный в настоящем приложении, используют в отношении чистых бакте
риальных культур только для подтверждения принадлежности выделенных штаммов.
С.2 Сокращения
О.П.: отдельная проба.
С.З Порядок проведения метода
С.3.1 Сущность метода
Методоснован на ПЦР-амплификации специфических областей ДНК из ДНК-матрицы, с олигонуклеотидами,
вызывая начало реакции ПЦР.
Обнаружение sfx1. s/x2 и
еае
генов проводят с помощью мультиплексной ПЦР с использованием специфи
ческих праймеров (см. таблицу С.1). Метод состоит из следующих этапов.
- пробоподготовка:
- проведение ПЦР;
- визуализация продуктов ПЦР с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле.
С.3.2 Пробоподготовка
Полученные бактериальные культуры на твердых питательных средах, например на триптон-соевом агаре
(TSA), обрабатывают следующим образом;
- отбирают одну колонию стерильной петлей, захватывающей объем 1 мм3;
- пробоподготовка осуществляется путем суспендирования бактерий в 100 мм3стерилизованной воды, деи
онизированной путем фильтрации через фильтр miiliQ1>с диаметром пор 0,22 мкм, с последующим кипячением в
течение 10 мин.
С.3.3 Проведение ПЦР
Для каждой пробы готовится отдельно 50 мм3 реакционной смеси, состоящей из реакционного буфера,
MgCI2 в концентрации 1,2 ммоль/дм3, дезоксинуклиотидфосфатаз (dNTP) в концентрации 0,2 ммоль/дм3 каждой, 50
пмоль каждого праймера. 2 единицы Taq-полимеразы и 10 мм3 ДНК-матрицы.
Объем реагентов зависит от конечного обьема реакции. При проведении ПЦР-реакций используют деиони
зованную воду, указанную в С.3.2.
Проведение каждой ПЦР включает в себя положительный и два отрицательных контроля. ДНК-матрицу для
положительного контроля получают из штамма
E.coh,
гарантированно содержащего гены вирулентности, в то время
как отрицательным контролем служит ДНК-изолят от непатогенных штаммов
E.coli
(не несущих в своем геноме генов
вирулентности), вторым отрицательным контролем служит реакционная смесь без добавления матричной ДНК.
Проведение реакции происходит в амплификаторе с запрограммированным тепловым профилем (см. [11] и
таблицу С.1).
С.3.4 Электрофорез в агарозном геле
Готовят раствор агарозы в концентрации 20 г/дм3 в однократном трис/борат/ЭДТА (ТВЕ) или трис/этилацетат/
ЭДТА (ТАЕ) буфере. Заполняют каждую лунку затвердевшего агарозного геля продуктами ПЦР в объеме 15 мм3,
1* MilliQ является торговым наименованием продукции, поставляемой Millipore Corporation. Данная инфор
мация приведена для удобства пользователей настоящим стандартом и не является рекламой ISO данной про
дукции. Допускается применение аналогичных продуктов, если доказано, что они обеспечивают получение сопо
ставимых результатов.
13