rOCTISO/TS 13136—2016
Приложение F
(обязательное)
Выделение чисты х штаммов STEC
Данную методику используют для выделения чистых штаммов STEC из проб, положительно прореагировав
ших на ПЦР в режиме реального времени.
a) В случае положительного результата о присутствии одного из генов, связанных с серогруппами рассма
триваемых в рамках настоящего стандарта, проводится процедура обогащения, для облегчения выделения STEC
(см. примечание 1).
b
) Обогащение проводится на культуральных средах для обогащения SSE или на ТВХ или другой подходя
щей среде (см. примечание 2). Инкубируют в течение 18 ч до 24 ч при температуре (37 ± 1) "С.
c) 50 колоний £. сой с характерной морфологией или с характерными признаками (см. примечание 5) снима
ют с питательного агара (NA) (см. примечание 3) и переносят в пробирки с водой (колонии могут быть объединены
в воде в общей сложности по 10).
d) Проводят детекцию на наличие sfx-кодирующих генов в изолированных колониях, перенесенных в воду
(см. примечание 4).
e) Если проба будет положительной, высевают клетки на питательный агар для анализа отдельных колоний,
чтобы выделить одну положительную колонию.
f) Идентифицируют колонии, как
Е. coli.
и подтверждают наличие еае-гена и принадлежность к серогруппе
(например, с помощью ПЦР в режиме реального времени (см. приложении F. а также примечание 5).
д) Изоляты ДНК могут быть отправлены в референс-лабораторию для дальнейшего подтверждения.
П р и м е ч а н и е 1 — Обогащение конкретных серогрупп можно провести с помощью иммунологических
систем, таких как IMS или ее эквивалентов, при этом, как правило, следуют инструкциям производителя.
П р и м е ч а н и е 2 — Для подтверждения принадлежности проб к 0157 серогруппе применяют [19] или аль
тернативные методы, валидированые в соответствии с 118). Принадлежность к сорбитол-ферментирующим £.
coli
еврогруппы 0157 определяют наличием теллурита. используя селективную среду СТ SMAC согласно [19]. Поэтому
является целесообразным использование дублирующей чашки Петри с SMAC без антибиотиков.
Для выделения STEC, принадлежащих к серогруппе 026. используют селективную плотную питательную
среду (МакКонки). которая содержит рамнозу вместо лактозы (RMAC). Это очень эффективный способ выявления
штаммов STEC серогруппы 026. которые не ферментируют рамнозу в отличие от других видов £.
coli.
П р и м е ч а н и е 3 — Существует несколько типов питательных сред на основе агара, либо в виде готовых
к использованию чашек или для приготовления в лаборатории из сухих порошков. Каждый тип неселвктивной
питательной агаровой среды (например. TSA) подходит для целей выращивания колониидля дальнейшей диффе
ренциации. Также можно использовать энгерогемолизический агар. Это имеет преимущество, так как способность
продуцировать энтерагемолезин является общим признаком STEC патогенных для человека.
П р и м е ч а н и е 4 — ПЦР в режиме реального времени, описанная в данном стандарте может быть ис
пользована для подтверждения наличия генов
stx
и еае в геноме клеток выделенных штаммов. Стандартная ПЦР
может быть использована в качестве альтернативы (см. приложение В).
П р и м е ч а н и е 5 — Подтверждение принадлежности колоний к £. сой можно провести при использовании
любого коммерческого биохимического анализа, либо по способности клеток выделять индол. Дифференциация по
серогрулпам может быть проведена либо с помощью ПЦР. либо с помощью реакции агглютинации с использо ванием
коммерческой антисыворотки.
19