ГОСТ ISO/TS 13136—2016
смешанных с красителем. Электрофорез проводят в однократном буфере (ТВЕ или ТАЕ) при постоянном напря
жении (100 V). Использование маркера молекулярного веса позволяет определить необходимые молекулярные
массы полученных ампликоное (см. таблицу С.1).
П р и м е ч а н и е — Правильное определение полос в агарозном геле, после проведения электрофореза,
является важным моментом в оценке наличия генов вирулентности. Убедитесь, что полосы, полученные на поло
жительном контроле, точно соответствуют определенной молекулярной массе.
В агарозный гель необходимо добавить бромистый этидий для визуализации продуктов ПЦР. При воздей
ствии на данный реактив ультрафиолетового излучения он флуоресцирует красно-оранжевым цветом. Конечная
концентрация бромистого этидия составляет 0.5 мкг/см3 при добавлении перед запивкой агарозного геля в план
шет для гель-электрофореза.
В качестве альтернативы допускается окрашивание агарозного геля после электрофореза в водном раство
ре этидий бромида концентрацией 0.5 мкг/см3.
С.3.5 Оборудование
Используют обычное оборудование, необходимое для микробиологической лаборатории (см. ISO 7218) и. в
частности, следующее.
С.3.5.1 Ламинарный бокс для ПЦР.
С.3.5.2 Дозатор, вместимостью 1 см3 стерильный.
С.3.5.3 Стерильные бактериологические петли.
С.3.5.4 Флаконы из боросиликатного стекла, вместимостью 500 см3.
С.3.5.5 Цилиндры из боросиликатного стекла, вместимостью 500 см3.
С.3.5.6 Цилиндры из боросиликатного стекла, вместимостью 1дм3.
С.3.5.7 Термостат, способный поддерживать температуру на уровне (37 ± 1) "С.
С.3.5.8 Технические настольные весы.
С.3.5.9 Автоклав.
С.3.10 Устройстводля раскапывания.
С.3.5.11 Микропипетки.
С.3.5.12 Наконечники для микропипеток, стерильные.
С.3.5.13 Микропробирки, вместимостью 1.5 см3.
С.3.5.14 Микропробирки для ПЦР. вместимостью 0,2 или 0.5 см3.
С.3.5.15 Амплификатор.
С.3.5.16 Магнитная мешалка.
С.3.5.17 Магнитное устройство для перемешивания.
С.3.5.18 Деионизатор воды.
С.3.5.19 Камера для электрофореза.
С.3.5.20 УФ-трансиллюминатор.
С.3.5.21 Льдогенератор.
С.3.5.22 Микроволновая печь.
С.3.6 Реактивы и среды
В ходе анализа, если не указано иное, используются реактивы ч. д. а. и стерильная дистиллированная или
деминерализованная вода или вода эквивалентной чистоты.
С.3.6.1 Агар микробиологический.
С.3.6.2 Раствор dNTP.
С.3.6.3 Синтетические олигонуклеотидные праймеры.
С.3.6.4 Taq ДНК-полимераза и десятикратный реакционный буфер с или без MgCI2
С.3.6.5 Буфер для электрофореза.
С.3.6.6 Маркер молекулярного веса ДНК.
С.3.6.7 Краситель для внесения в продукты ПЦР.
С.3.6.8 Агароза.
С.3.6.9 Раствор этидия бромида или другой краситель ДНК в геле.
С.3.7 Безопасность и защитные устройства
Некоторые штаммы STEC могут инфицировать людей при очень низкой инфекционной дозе и могут вы
звать серьезные заболевания. Были зарегистрированы случаи инфицирования в лаборатории. Поэтому, работая с
STEC. требуются профессиональные навыки работы в лаборатории и использование защитных устройств. Этидия
бромид является мутагенным и токсичным реагентом, поэтому им необходимо пользоваться соблюдая технику
безопасности и применяя средства защиты (лабораторный халат и латексные перчатки). Ультрафиолетовое излу
чение может привести к повреждению глаз, в связи с этим является обязательным использование полиметилмета-
крипагных щитов и защитных очков.
С.3.8 Штаммы микроорганизмов и контроля для ПЦР
В качестве положительного контроля используют STEC штаммы микроорганизмов несущие в своем геноме
гены slx1,
stx2
и гены
вав.
Примером может служить эталонный штамм Е. со//0157 EDL933 (WDCM 00188. см. [12].
[13])-
14