ГОСТ 33379—2015
8.4.3 При анализе пробы органического удобрения с предполагаемой высокой степенью загряз
нения бактериями кишечной палочки допускается проводить прямой поверхностный посев разведений
на среду Эндо в количестве 0,10 или 0.05 см3 обычным способом. Для этого среду Эндо заранее раз
ливают в чашки Петри и подсушивают в сушильном шкафу до «муаровой» пленки. Посовы инкубируют в
термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч.
8.4.4 Для идентификации выросших на авизованных средах характерных колоний готовят из
них мазки и сначала окрашивают по Граму, затем исследуют на присутствие оксидазы и способность
ферментировать лактозу. Если оксидазный тест оказался положительным, то на способность фермен
тировать лактозу колонии не исследуют.
8.4.4.1 БГКП являются грамотрицательными палочками, поэтому при окраске по Граму не окра
шиваются и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином или сафранином они
приобретают розовую окраску.
На обезжиренное этиловым спиртом предметное стекло наносят петлей одну каплю дистилли
рованной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии, полученной по
8.4.2—8.4.3. и распределяют по всей поверхности. Мазок высушивают при комнатной температуре и
фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. Затем на полученный препарат накладыва
ют полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генцианового фиолетового
на 0.5— 1.0 мин. снимают бумагу, наливают раствор Люголя на 0.5—1.0 мин. сливают раствор Люголя и
промывают стекло в этиловом спирте в течение 0.5—1.0 мин. пока не смоется весь краситель. Затем
стекло тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение 1—2 мин фуксином
Циля, разведенным в соотношении 1:10 с дистиллированной водой. Поело промывания дистиллиро
ванной водой и просушивания препарата при комнатной температуре втечение пяти минут полученный
мазок микроскопируют.
8.4.4.2 Для постановки оксидазного теста полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую
чашку Петри и смачивают двумя-тремя каплями реактива для оксидазного теста. Готовую бумажную
систему для оксидазного теста (СИБ-оксидазу) смачивают дистиллированной водой.
Часть изолированной колонии, полученной по 8.4.2—8.4.3. стеклянной палочкой или платиновой
петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом
на подготовленную фильтровальную бумагу.
Бактерии группы кишечной палочки — оксидазоотрицательные микроорганизмы. Реакция счита
ется положительной, если втечение 1 мин появляется фиолетово-коричневое окрашивание штриха при
использовании реактива для оксидазного теста или синее — при использовании СИБ-оксидазы. При
отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется.
Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно чет
кий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации
оксидазный тест повторяют.
8.4.4.3 Оставшуюся часть колонии, полученной по 8.4.2—8.4.3. после окраски по Граму и отри
цательного результата оксидазного теста засевают параллельно в две пробирки с полужидкой средой,
содержащей лактозу. Посев проводят уколом до дна пробирки и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в
течение 48 ч. Готовую бумажную систему для лактозного теста (СИБ-лактозу) смачивают дистилли
рованной водой.
Часть изолированной колонии, полученной по 8.4.2—8.4.3. стеклянной палочкой или платиновой
петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом
на подготовленную фильтровальную бумагу.
Бактерии группы кишечных палочек способны ферментировать лактозу с образованием кислоты
и газа. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется. При газообразовании газ ска
пливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. Первичный учет
образования кислоты и газа на полужидкой среде с лактозой или СИБ-лактозе возможен через 4—6 ч.
При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. Втаких случаях на присутствие газа ука
зывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.
При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окон
чательного учета БГКП после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют
для окончательного учета до 48 ч.
Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошен
ный питательный агар и после инкубации в течение 18—24 ч выполняют все необходимые подтверж
дающие тесты.
18