ГОСТ 32429-2013
3.3 Несколько методов измерения были успешно разработаны и стандартизированы для
повседневного использования. Это касается конкретных видов иммуноферментного анализа (ИФА),
использующихся в иммунохимии методов для количественного определения вителлогенина,
синтезированного в малых образцах крови или печени, собранных от отдельных особей рыб.
Образцы для измерения VTG отбирают у трех видов: тупоголового гольяна (кровь), данио рерио
(кровь или гомогенат) головы/хвоста и медаки японской (печень). У медаки наблюдается хорошая
корреляция между концентрацией VTG. измеренной в крови и печени. Наборы для измерения
вителлогенина широко доступны; такие наборы должны быть основаны на утвержденном
видослецифичном методе ELISA.
3.4 Вторичные половые признаки у самцов рыб отдельных видов являются вполне
различимыми, определяются количественно и реагируют на уровни циркулирующих эндогенных
андрогенов, в случае толстоголового гольяна и медаки. но не для данио рерио, не обладающего
вторичными половыми признаками, которые возможно измерить количественно. Самки обнаруживают
способность формировать мужские вторичные половые признаки, когда они подвергаются действию
андрогенных веществ в воде. Уменьшение вторичных половых признаков у самцов следует
интерпретировать с осторожностью из-за низкой статистической достоверности, и они должны быть
подтверждены экспертными оценками и убедительными доказательствами. Существуют ограничения к
использованию данио рерио в этом пробит анализе, в связи с отсутствием измеримых вторичных
половых признаков, чувствительных к действию ацдрогенотоксичных веществам.
3.5 У толстоголового гольяна главным индикатором воздействия экзогенного андрогена
является количество брачных бугорков, расположенных на передней части головы самки. У медаки
главным маркером экзогенного воздействия андрогенов является число папиллярных бугорков у
самок рыб.
4 Принцип теста
4.1 В пробит анализе самцы и самки рыб репродуктивного возраста подвергаются воздействию
совместно в тестовых сосудах. Состояние разведения позволяет дифференцировать каждый пол. и
таким образом связать результаты с анализом каждой конечной точки, что гарантирует их
чувствительность к экзогенным химическим веществам. По завершению теста пол подтверждается
макроскопическим исследованием гонад после вскрытия брюшной полости ножницами.
Исследование начинают с отбора рыб. из поголовья, которое находится в состоянии
икрометания: старые животные не должныиспользоваться. Исследование проводится с
использованием трех концентраций воздействия химического вещества, плюс «чистый» контроль, и
контрольная проба с растворителем, если это необходимо. Используют два параллельных испытания
(каждый сосуд, содержит пять самцов и пять самок) для медаки или данио рерио. тогда как для
гольяна используют четыре репликации (каждый сосуд, содержит двух самцов и четырех самкок).
Этот принцип учитывает территориальное поведение самцов тупоголового гольяна, сохраняя при
этом достаточную точность анализа. Время экспозиции составляет 21 день, отбор образцов также
осуществляется на 21 день.
4.2 На 21 день все рыбы подвергаются эвтаназии. Вторичные половые признаки измеряют на
толстоголовом гольяне и медаке; отбирают образцы крови для определения вителлогенина у данио
рерио и гольяна, альтернативно голова’хвост могут быть отобраны для определения вителлогенина у
данио рерио; печень собриряют для анализа VTG у медаки.
5 Критерии достоверности теста
Для результатов теста могут быть применены следующие условия:
-смертность в воде (или растворителе) не должна превысить 10 процентов на момент
окончания периода воздействия;
-концентрация растворенного кислорода должна составлять, по крайней мере. 60 процентов от
концентрации насыщения кислородом воды при температуре эксперимента;
-температура воды не должна колебаться более, чем на ± 1,5 вС между тестовыми сосудами в
любой момент проведения теста, и поддерживаться в пределах диапазона в 2 °С, определенных для
тестируемых видов;
-полученные данные должны демонстрировать, что концентрации тестируемого вещества в
растворе поддерживаются в пределах ± 20 % от средневзвешенных значений.
2