ГОСТ 32429-2013
Приложение Н
(справочное)
Рекомендуемые процедуры для типового определения содержания вителлогенина
Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения между
образцами VTG самцов и самок.
Процедура 1А: Тупоголовый гольян, забор крови из хвостовой вены/артерии
После анестезии хвостовую часть надрезают скальпелем и собирают кровь из хвостовой
вены/артерии с помощью капиллярной пипетки гепариновым микрогематокритом. После того, как
кровь собрана, быстро отделяют плазму центрифугированием в течение 3 минут при 15 000 g (или
альтернативно 10 мин. при 15,000 g при 4 °С). Процент гематокрита в конечном итоге может быть
определен после центрифугирования. Затем плазму удалена пипеткой с микрогематокритом и хранят в
пробирке центрифуги с 0.13 единицами апротинима (ингибитор протеазы) при минус 80 °С, до
анализа вителлогенина. В зависимости от размера тупоголового гольяна (который зависит от пола),
собранные объемы плазмы колеблются от 5 до 60 микролитров на рыбу (Jensen и др. 2001).
Процодура 1В: тупоголовый гольян, сбор крови пункцией сердца
Альтернативно, кровь может быть также собрана проколом сердца, с помощью
гепаринизированного шприца (1000 единиц гепарина на мл). Кровь переносят в пробирки
Эппендорфа (выдержанные на льду) и затем центрифугируют (5 минут, 7 000 g при комнатной
температуре). Плазму перелить в чистые пробирки Эппендорфа (аликровтно, если объем плазмы это
позволяет) и быстро заморозить при минус 80 °С до проведения анализа (Panter и др., 1998).
Процедура 2А: японская медака, удаление печени
Удаление тестируемой рыбы из испытательной камеры:
(1) Тестируемая рыба должна быть удалена из испытательной камеры с использованием
сачка с мелкой сеткой. С осторожностью выпускайте тестируемую рыбу в другие испытательные
камеры.
(2) Тестируемые рыбки должны быть удалены в следующем заказе: контроль растворителя
(если необходимо), самая низкая концентрация, средняя концентрация, самая высокая концентрация
и положительный контроль. Кроме того, все самцы должны быть удалены из испытательной камеры
раньше самок.
(3) Пол каждой тестируемой рыбы идентифицируют по внешним вторичным половым
признакам (например, форме анального плавника).
(4) Поместите тестируемую рыбу в контейнер для транспортировки и перенесите их на
рабочее место для удаления печени. Проверьте этикетки тестовых аквариумов и транспортного
контейнера для точности и убедитесь, что количество рыб, которые были удалены из тестового
аквариума, и количество выловленных рыб. совпадают.
(5) Если пол не может быть идентифицирован по внешнему виду рыбы, удалите всю рыбу из
тестового аквариума. В этом случае пол должен быть идентифицирован по анализу гонад или
вторичным половым признакам под бинокулярным микроскопом.
Удаление печени:
(1) Перенесите тестируемую рыбу из транспортного контейнера в анестезирующий раствор,
используя сачок с мелкой сеткой.
(2) После того, как тестируемая рыба обезболена, переложите ее на фильтровальную бумагу
(или бумажное полотенце) с помощью пинцета (обычного тип), захватывая тестируемую рыбу
пинцетом за боковые поверхности головы, чтобы предотвратить ломку хвоста.
(3) Вытрите воду с поверхности тела тестируемой рыбы фильтровальной бумагой (или
бумажным полотенцем).
(4) Положите рыбу на спинку. Сделайте малый поперечный разрез брюшка от проекции
затылка до середины брюшной области, с помощью препарационных ножниц.
(5) Вставьте препарационные ножницы в разрез и расширьте его от задней части жабр до
ануса вдоль средней линии живота. Старайтесь не вставлять ножницы слишком глубоко, чтобы не
повредить печень и гонады.
(6) Проведите следующие операции под бинокулярным микроскопом.
(7) Разместите рыбу на спине на бумажном полотенце (или стеклянной чашке Петри, или на
19