ГОСТ 32429-2013
(3) Включите гомогенизатор на 10 - 20 секунд. Охлаждайте микропробирку измельченным
льдом во время операции.
(4) Выньте пилон из микропробирки и оставьте ее в покое приблизительно на 10 секунд. Затем
осуществите визуальную проверку состояния суспензии.
(5) Если в суспензии наблюдаются частички печени, повторите операции (3) и (4). чтобы
подготовить однородный гомогенат печени.
(6) Охладите суспендированный гомогенат печени на льду перед центрифугированием.
(7) Замените пилон на новый для каждого гомогенирования.
(8) Гомогенизируйте всю печень с гомогенатным буфером согласно процедуре, описанной
выше.
3 Центрифугирования суспендированного гомогената печени
(1) Установите температуру охлаждающей камеры центрифуги на s 5°С.
(2) Вставка микропробирки на 1.5 мл, содержащая суспендированный гомогонат печени в
охлаждающую центрифугу (отрегулируйте баланс в случае необходимости).
(3) Центрифугируйте суспендированный гомогенат печени при 13000 g в течение 10 минут при s
5X .Однако,еслисупернатанткорректноотделился,центробежнаясилаивремя
центрифугирования могут быть соответственно скорректированы.
(4) После центрифугирования проверьте, что супернатант качественно отделился (на
поверхности - липиды, промежуточные - супернатант . Осадок - ткани печени). Если разделение не
качественно, центрифугируйте суспензию снова при тех же самых условиях.
(5) Удалите все образцы для испытания из охлаждающей центрифуги и установите их в
емкости со льдом в порядке проведения испытания. Старайтесь не взболтать пробирки.
4 Сбор супернатанта
(1) Поместите четыре микролробирки на 0.5 мл в штатив для хранения супернатанта.
(2) Возьмите 30 мкл каждого супернатанта (сформированного как промежуточный слой)
микропипеткой и соберите его в одной микропробирке на 0.5 мл. Старайтесь не собирать липиды с
поверхности или ткани печени в осадке.
(3) Соберите супернатант и распределите его на две другие микропробирки на 0.5 мл тем же
способом, как описано выше.
(4) Соберите остальную часть супернатанта микропипеткой (если возможно: г 100 pL).
Распределите супернатант на оставшиеся микропробирки на 0.5 мл. Старайтесь не собирать липиды с
поверхности или ткани печени в осадке
(5) Закройте колпак микролробирки на 0.5 мл и запишите объем супернатанта на ярлыке. Затем
немедленно охладите микролробирки на льду.
(6) Заменяйте наконечник микропипетки на новый для каждого образца супернатанта. Если к
наконечнику прилипает большое количество липидов, немедленно замените наконечник, чтобы
избежать загрязнения экстракта печени жиром.
(7) Распределите весь центрифугируемый супернатант на четыре микролробирки по 0.5 мл
согласно процедуре, описанной выше.
(8) После распределения супернатанта на микролробирки по0.5 мл. поместите их в штатив
с идентифицирующими этикетками и затем немедленно заморозьте их в морозильнике. Если
концентрации VTG измеряется непосредственно после предварительной обработки, держите одну
микролробирку на 0.5 мл (содержащий 30 мкл супернатанта) в охлаждающем штативе и передайте
его на рабочее место проведения анализ ELISA. В этом случае, поместите оставшиеся
микролробирки в штатив и заморозьте их в морозильнике.
(9) После сбора супернатанта утилизируйте остаток в соответствии с принятой процедурой.
Хранение испытательных образцов.
Храните микролробирки на 0.5 мл, содержащие супернатант гомогената печени при s минус 70
X . до проведения анализа ELISA.
Процедура ЗА: Данио рерио. сбор крови из хвостовой арторииУвены
Незамедлительно после анестезии делается рассечение возле хвоста и кровь из хвостовой
артерии/вены собирается в микрогематокритные капиллярные трубки с гепарином. Объемы крови
колеблются от 5 до 15 микролитров в зависимости от размера рыбы. Равный объем буфера
апротинина(6 мкг/мл в фосфатном буферном растворе (ФБР)) добавляется в микрокалиллярные
трубки и отделяют плазму от крови центрифугированием (5 минут при 600 д). Плазму собирают в
пробирки и хранят при минус 20 X до проведения анализа на вителлогенин или другие белки.
П£оуо£^£а1ЗВ: Данио рорио, сбор крови пункцией сердца
Чтобы избежать коагуляции крови и разложения белка, образцы собирают в фосфатный
буферный раствор содержащий гепарин(1000 ед/мл) и ингибитор протеазы апротинин (2 TIU/мл).
Для приготовления буфера рекомендуются гепарин, соль аммония и лиофилизированный апротинин.
25