ГОСТ 32429-2013
7.4.4 Наблюдение за вторичными половыми признаками
Некоторые эндокринные нарушения могут влиять на вторичные половые признаки (количество
брачных бугорков у самцов тупоголового гольяна, папиллярные бугорки у самцов медаки). Некоторые
вещества могут также вызывать аномальные проявления вторичных половых признаков
представителей другого пола; например, антагонисты рецепторов андрогена, такие как тренболон.
метилтестостерон и дигидротестостерон, могут привести к развитию у самок тупоголового гольяна
брачных бугорков или появлению папиллярных полос у самок медаки. Также было отмечено, что
антагонисты рецепторов эстрогена могут привести к уменьшению числа брачных бугорков и размера
затылочной подушки у взрослых самцов. Такие морфологические наблюдения могут предоставить
полезнуюкачественнуюиколичественнуюинформациюприпланированиидальнейших
исследований. Число и размер брачных бугорков у гольяна и папиллярные бугорки у медаки могут
быть определены количественно непосредственно в ходе эксперимента или позднее в сохраненных
образцах.
7.4.5 Вителлогенин (VTG)
7.4.5.1 Кровь собирают из хвостовой артерии/вены капиллярной трубочкой с гепарином с
помощью микро гематокрита или шприцем с помощью пункции сердца. В зависимости от размера
рыбки собираемые объемы крови колеблются от 5 до 60 мкл для гольяна и от 5 до 15 мкл для данио.
Плазму отделяют от крови центрифугированием и хранят с ингибиторами протеазы при минус 80 5С до
анализа на VTG. У медаки для анализа используется печень, у данио также может использоваться как
источник ткани для анализа вителогенина гомогенат головыУхвоста. Измерение VTG должно
проводиться по утвержденному гомологическому методу ELISA с использованием гомологических
стандартов и антител VTG. Рекомендуется использовать метод, способный обнаружить VTGв
плазме на уровне нескольких нг/мл плазмы(нг/мл ткани), который является фоновым уровнем для
интактных самцов рыб.
7.4.5.2 Контроль качества анализа VTG достигается с помощью стандартных наборов
химикатов и дублированием анализа. Для каждого метода ELISA строится матрица эффекта (эффект
разбавления пробы) для определения минимального фактора разбавления. Каждая пластина ELISA,
используемая для анализа VTG, должна включать следующие контрольные образцы; шесть
стандартных калибровочных растворов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций
вителлогенина, и один холостой опыт, проанализированный в двух повторностях. Степень
поглощения света в холостых пробах должна составить меньше 5 % максимальной абсорбции
стандартного калибровочного раствора. Должны быть проанализированы две пробы каждого
типового разбавления. В случае разброса между повторностями более чем на 20 % анализ
повторяют.^
7.4.5.3 Коэффициент корреляции (R ) для калибровочных кривых должен быть больше 0.99.
Высокая степень корреляции недостаточна, для того чтобы гарантировать адекватное предсказание
концентрации во всех диапазонах. В дополнение к наличию достаточно высокой корреляции значений
калибровочной кривой к концентрации каждого стандарта вычисляют кривую стандартных растворов,
которая должна находиться между 70 % и 120 % от ее номинальной концентрации. Если номинальная
концентрация расположена далеко от линии регрессии калибровочного графика (например, при
более низких концентрациях), это может привести к необходимости разбить калибровочную кривую в
низком и высоком диапазонах или к использованию нелинейной модели, чтобы иметь возможность
использовать полученные результаты абсорбции. Если кривая разбита, каждый ее сегмент должен
иметь R > 0.99.
7.4.5.4Пределобнаружения(LOD)обозначаетсякакконцентрациянаименьшего
аналитического стандарта, предел количественного определения (LOQ) понимают как наименьшую
концентрацию наименьшего стандарта, умноженную на самый низкий фактор разбавления.
7.4.5.5 В день выполнения анализа на вителлогенин. проводят анализ усиленного образца
стандартного раствора. Так же систематически сверяют отношения между ожидаемой и измеренной
концентрацией, выполненной в тот же день.
8 Результат и отчет
8.1 Оценка ответов биомаркеров с помощью дисперсионного анализа (ANOVA)
Чтобы идентифицировать потенциальное воздействие вещества на эндокринную систему,
сравнивают результаты опытной и контрольной групп, с помощью дисперсионного анализа (ANOVA).
Если используется контроль, содержащий растворитель, соответствующий статистический тест
должен быть выполнен между контролем с водой и контролем с растворителем для каждого
наблюдаемого эффекта.
6