ГОСТ 32429-2013
Для забора крови рекомендуется шприц (1 мл) с неподвижной тонкой иглой (например. Braun
Omnikan-F). Шприц должен быть предварительно наполнен буфером (приблизительно 100 мкл),
чтобы полностью элюировать малые объемы крови от каждой рыбки. Образцы крови берутся
проколом сердца. Рыба вначале должна быть анестезирована MS 222 (трикаин метанесульфонат)
(100 мг/л). Правильно примененная анестезия позволяет различить сердцебиение данио. Прокалывая
сердце, держите поршень шприца под небольшим давлением. Собираемые объемы крови
составляют от 20 до 40 мкл. После пункции сердца кровь/буферная смесь должна быть перенесены в
пробирку. Плазма отделяется от крови центрифугированием (20 минут; 5000 д) и должна храниться
при минус 80 еС до проведения анализа.
Процедура ЗС: Стандартнаяоперационная процедура: Данио рерио,гомогенизация головы и хвоста
Для анализа ВТГДля гистологии гонад
/
Для анализа ВТГ
Рисунок Н.9
1 Рыбы подвергнуты анестезии и эвтаназии в соответствии с описанием в тесте.
2 Голова и хвост рыбы отрезаются в соответствии с рисунком Н.9. Важно; Все инструменты
для вскрытия так же. как и препарационный стол, должны быть вымыты и очищены должным
образом (например, с 96 %-ным этиловым спиртом) между обработкой каждой конкретной рыбы,
чтобы предотвратить «загрязнение вителлогенином (ВТГ)» от самок или чтобы индуцированные
самцы не «загрязнили» интактных самцов.
3 Общий вес головы и хвоста каждой рыбы взвешивается с точностью до мг.
4 После взвешивания части помещают в соответствующие пробирки (например. Эппендорфа
на1.5 мл) и замораживают при минус 80 °С до момента гомогенизации или сразу гомогенизируют на
льду с двумя пластиковыми пестиками. (Могут использоваться другие методы, если они
проводятся на льду и дают результат - однородную массу). Важно; пробирки должны быть
пронумерованы так. чтобы голова и хвост от рыбы могли быть связаны с
соответствующей частью тела, используемой для гистологии гонад.
5. Для получения однородной массы добавляют ледяной гомогенизационный буфер1 в
количестве четырёх от измеренного веса ткани. Продолжайте работать с пестиками, пока смесь не
станет гомогенной. Важное замечание; Используются новые пестики для каждой рыбы.
6 Образцы помещены в лед до центрифугирования при 4 °С при 50000 g в течении 30 мин.
7 Используйте пипетку для забора 20 мкл супернатанта по крайней мере в двух пробирках,
опуская конец пипетки ниже плотного слоя на поверхности и тщательно собирая супернатант без
жира или частиц ткани.
8 Пробирки хранят при минус 80 =Сдо использования.
Гомогенизационный буфер:
(50 ммоль трис-HCI с pH 7.4; 1% смеси ингибиторов протеаз (Сита)]: 12 мл трис-HCI с pH 7.4 +120 мкл смеси
ингибиторов протеаз.
- ТРИС: ТРИС-УЛЬТРА ЧИСТЫЙ (ICN) например, производства Bie & Berntsen (Danemark)
- Смесь ингибиторов протеаз: производства Signra (из тканей животных). Номер продукта Р 8340.
ВАЖНО. Гомогенизационный раствор используется в день приготовления. Держите раствор на льду во время
использования.
26