ГОСТ ISO 21149—2013
13.3.4 Валидация метода мембранной фильтрации
Смешивают соответствующее количество исходной суспензии пробы или ее разведения, исполь
зованного в испытании (см. 9.3.2.3). и соответствующее количество калиброванной суспензии микро
организмов. количество клеток в которой соответствует приблизительно 100 КОЕ/см3.
Фильтруют сразу же весь объем и промывают мембранный фильтр, используя необходимые объ
емы воды (5.1). разбавителя (5.2.3) или нейтрализатора (5.2.2). Переносят мембранный фильтр на по
верхность соответствующей агаризованной среды (5.4.2).
Параллельно готовят контрольный посев при условиях, описанных выше, но без пробы продук
ции. Фильтруют и промывают контроль при тех же условиях.
После инкубации в течение 24-72 ч при температуре (32.5 ± 2.5) °С подсчитывают колонии на
мембранных фильтрах и сравнивают с результатами, полученными при испытании, и результатами кон
трольного испытания. Метод мембранной фильтрации и разбавитель считают подходящими, если ко
личество микроорганизмов составляет по крайней мере 50 % (0.3 log) от количества микроорганизмов в
контрольной пробе.
13.4 Валидация метода обнаружения микроорганизмов с использованием обогащения
13.4.1 Проведение испытания
В пробирках, содержащих по 9 см3 разбавителя для бактериальных суспензий (5.3). готовят ряд
разведений штамма каждой калиброванной суспензии, для того чтобы получить количество клеток от
100 до 500 КОЕ/см3. Для подсчета окончательной концентрации жизнеспособных микроорганизмов в
стандартной суспензии переносят 1см3 суспонзии в чашку Петри и заливают 15-20 см3расплавленной
агаризованной среды (5.4.2), выдержанной на водяной бане при температуре не выше 48 еС.
Инкубируют при температуре (32,5 ± 2.5) °С в течение 20-24 ч.
Выполняют два параллельных приготовления (две повторности) исходной суспензии пробы (3.3) в
условиях, выбранных для анализа (не менее 1г или 1 см3продукции, определенный объем бульона для
обогащения (5.4.3.2)), используя пробирки или колбы. В одну пробирку (испытание на подтверждение)
асептически вносят 0.1 см3стандартной суспензии микроорганизмов. Смешивают, затем инкубируют каж
дую пробирку (тестирование на валидацию и контроль) при температуре (32,5 ♦ 2,5) еС в течение 20-24 ч.
Используя стерильную пипетку, из каждой пробирки или колбы переносят по 0.1-0.5 см3 (при
тех же условиях, что и в испытании) инкубированной смеси на поверхность чашки Петри (диаметром
85-100 мм), содержащей приблизительно 15-20 см3соответствующей агаризованной среды.
Инкубируют чашки при температуре (32.5 ± 2.5) °С в течение 24-72 ч.
13.4.2 Интерпретация результатов
В отношении каждого штамма проверяют, чтобы стандартная суспензия микроорганизмов содер
жала от 100 до 500 КОЕ/см3.
Нейтрализация и метод обнаружения валидируются, если детектируется характерный рост ми
кроорганизмов. такой как:
- для Staphylococcus aureus: культура пигментирована в желтый цвет;
- для Pseudomonas aeruginosa. зеленовато-желтая культура.
Культура инокулированного микроорганизма отмечается на чашке для подтверждения, рост на
контрольной чашке не отмечается.
Когда рост отмечается на контрольной чашке (контаминированная продукция), нейтрализация и
метод обнаружения подтверждаются в случае, если инокулированный микроорганизм был выделен на
валидационной чашке.
13.5 Интерпретация результатов валидации
Отсутствие роста на валидационных чашках Петри указывает на то. что антимикробная актив
ность по-прежнему присутствует и делает необходимым изменение условий данного метода. Это может
быть достигнуто увеличением объема питательного бульона (количество продукции остается одина
ковым). или введением достаточного количества инактивирующего агента в питательный бульон, или
соответствующей комбинацией изменений, для того чтобы обеспечить рост микроорганизмов.
Если, несмотря на введение соответствующих инактивирующих агентов и значительное увели
чение объема бульона, все еще невозможно регенерировать жизнеспособные культуры, как описано
выше, это указывает на то. что данная продукция, вероятно, не может быть контаминирована опреде
ленным видом микроорганизма.
11