ГОСТ ISO 21148—2013
А.2 Окраска по Граму [модифицированный метод Хакера (Hucker)]
А.2.1 Общие положения
Такое окрашивание бактериальных клеток позволяет описать морфологию клеток бактерий и классифициро
вать их на две группы в зависимости от того, способны они удерживать фиолетовую окраску кристаллического фи
олетового в условиях анализа или нет. Подобное деление обусловлено главным образом различиями в
структуре клеточных стенок двух групп и корродируется с другими существенными различиями между этими двумя
группами. Существует ряд способов выполнения окраски по Граму. однако все они следуют рекомендациям,
приведенным ниже.
А.2.2 Растворы
А.2.2.1 Общие положения
Можно использовать имеющиеся в продаже растворы. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя.
А.2.2.2 Раствор кристаллического фиолетового
А.2.2.2.1 Состав
- кристаллический фиолетовый — 2.0 г;
- этанол (95 %) — 20 см3;
- оксалат аммония (C2H8N20 4) — 0.8 г;
- вода — 80 см3.
А.2.2.2.2 Приготовление
Растворяют кристаллический фиолетовый в этаноле и оксалат аммония в дистиллированной воде. Смеши
вают два раствора и дают отстояться смеси в течение 24 ч перед применением.
А.2.2.3 Раствор йода
А.2.2.3.1 Состав
- йод — 1.0 г;
- йодид калия (KI) — 2,0 п
- вода — 100 см3.
А.2.2.3.2 Приготовление
Растворяют йодид калия в 10 см3 дистиллированной воды, добавляют йод частями. После растворения до
водят раствор до 100 см3 в мерной колбе.
А.2.2.4 Раствор сафранина
А.2.2.4.1 Состав
- сафранин О — 0,25 г;
- этанол (95 %) — 10 см3;
- вода — 100 см3.
А.2.2.4.2 Приготовление
Растворяют сафранин в этаноле, затем смешивают с дистиллированной водой. Доводят до окончательного
объема 100 см3.
При использовании кристаллического фиолетового следует проверить стабильность раствора. Для проверки
смешивают одну каплю раствора кристаллического фиолетового с одной каплей раствора йода на предметном сте
кле. чтобы проследить за химической реакцией. Если кристаллизация видна на стекле, раствор кристаллического
фиолетового не используют.
А.2.2.5 Метод окрашивания
Из культуры, выращенной в течение 18—24 ч. готовят мазок на предметно»/ стекле и фиксируют его над пла
менем спиртовки, затем на мазок наносят раствор кристаллического фиолетового (А.2.2.2) и дают прореагировать в
течение 1 мин.
Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой в течение нескольких секунд.
Покрывают предметное стекло раствором йода (А.2.2.3). Дают ему прореагировать в течение 1 мин. Осто
рожно наклоняя, промывают предметное стекло водой в течение нескольких секунд.
Осторожно и непрерывно промывают этанолом (95 %) предметное стекло в течение не более 30 с. до тех пор
пока не перестанет вымываться фиолетовый цвет.
Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой в течение нескольких секунд.
Докрашивают глазок раствором сафранина (А.2.2.4) в течение 10 с.
Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой.
Высушивают предметное стекло.
А.2.2.6 Интерпретация результатов
Исследуют предметное стекло под объективом микроскопа с большим увеличением (4.13). Те бактериаль
ные клетки, которые окрасились в синий или фиолетовый цвет, относятся к грамположительным бактериям, а окра
шенные в темно-розовый и красный — к грамотрицательным.
В отношении чистой культуры некоторых типов бактерий как грамположительные, так и грагиотрицательные
бактерии могут быть получены в одном и том же поле зрения микроскопа.
П р и м е ч ан и е — У плотно расположенных клеток может отмечаться нехарактерная реакция.
13