ГОСТ 31719—2012
Т аб лиц а 5 — Программа амплификации (качественного определения) фрагментов видоспецифичной ДНК жи
вотных (крупного рогатого скота, свиньи) в режиме реального времени
Этап
программы
Режим амплификации
ПроцессЧисло
ЦИКЛОВ
температура. "Свремя, с
194180Денатурация ДНК
1
9420Денатурация ДНК
245
60 60* Отжиг праймеров и синтез ДНК
* Включение оптики для детекции ПЦР — продуктов (в реальном времени): канал для красителей FAM.
7.4.6Проводят детекцию продуктов ПЦР в соответствии с описанием к используемой модели ам-
ллификатора (для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени).
8 Детекция (обнаружение) продуктов амплификации
8.1 Детекция продуктов амплификации фрагментов видоспецифичной ДНК растений
и животных методом электрофореза1>
8.1.1 Детекцию фрагментов амплификации проводят при помощи метода электрофореза в агароз
ном геле, реагенты для проведения которого собраны в специальный набор.
8.1.2 Содержимое пакета с надписью «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мер
ную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в 600—800 см3дистиллированной воды и доводят объ
ем полученного раствора до 1000 см3дистиллированной водой. Буфер хранят в течение года при ком
натной температуре.
8.1.3 Подготовку к работе прибора для горизонтального электрофореза проводят в соответствии
с прилагаемым к нему техническим описанием.
8.1.3.1 Размещают прибор на столе и с помощью регулируемых по высоте ножек, ориентируясь по
уровням, устанавливают прибор в фиксированное, строго горизонтальное положение.
8.1.3.2 Собирают кювету для заливки геля и устанавливают в нее от одной до четырех гребенок
(в зависимости от количества анализируемых проб) так. чтобы расстояние между зубцами соседних
гребенок и одной из стенок кюветы составляло не менее 2 см.
8.1.4 Содержимое одного из пакетов с надписью «Агароза» полностью переносят в коническую
термостойкую стеклянную колбу вместимостью 250 см3, добавляют 150 см3 готового раствора буфера
по 8.1.2 (концентрация геля — 1.5 %). Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в СВЧ-печи (при
средней мощности), периодически помешивая, и продолжают нагревать до совершенно прозрачного
состояния (1 мин).
8.1.5 Агарозу охлаждают до температуры от 55 *С до 60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромисто
го этидия. аккуратно перемешивают, а затем наливают в кювету для геля прибора для электрофореза,
не допуская образования воздушных пузырьков, так. чтобы толщина геля была не менее 5 мм. а зубцы
гребенок были погружены в него не менее чем на 4 мм.
8.1.6 После полного застывания (через 15—20 мин) из геля осторожно извлекают гребенки так.
чтобы не повредить образовавшиеся карманы. Кювету с готовым агарозным гелем переносят в элек-
трофорсзную камеру прибора.
8.1.7 В камеру для электрофореза заливают готовый раствор буфера для электрофореза так.
чтобы жидкость покрывала гелевую пластину слоем от 2 до 3 мм.
8.1.8 Отбирают 10 мкл продуктов ПЦР и осторожно вносят в карман гелевой пластины. При этом
следует соблюдать следующий порядок внесения проб: сначала — содержимое пробирки с К-, затем —
исследуемые пробы в строго фиксированной последовательности, и в последнюю очередь — содер
жимое пробирки с К+. Электрофорез проводят при напряжении от 100 до 150 В в течение 20—30 мин.
при этом красящий компонент ПЦР-смеси голубого цвета должен продвинуться не менее чем на 1 см от
старта.
О Детекцию данным методом проводят в случае анализа по 7.1. 7.2.
12