ГОСТ 31719—2012
7.2.5Плотно закрытые микропробирки центрифугируют в течение от 5 до 7 с на микроцентрифу-
ге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения ПЦР по программам,
указанным в таблицах 1 и 2. По окончании действия программы микропробирки извлекают из амплифи-
катора и в штативе передают на этап детекции продуктов ПЦР.
7.3 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных
с использованием наборов роагентов для проведения ПЦР с детекцией в режиме
реального времени
7.3.1 В штативе размещают и маркируют необходимое количество микропробирок с лиофильно
высушенной амплификационмой смесью (для ПЦР в реальном времени) по количеству анализируемых
проб, а также микропробирки для К- и К+. В случае исследования многокомпонентных продуктов число
микропробирок на одну пробу, а также число микропробирок для К- и К+ рассчитывают исходя из того,
какое число видов ДНК планируется идентифицировать.
7.3.2 В каждую микропробирку с ПЦР — смесью (для ПЦР в реальном времени) при помощи
автоматического дозатора последовательно вносят и 10 мкл ПЦР-растворителя и 10 мкл смеси прай
меров для выявления конкретного фрагмента видоспецифичной ДНК того или иного компонента рас
тительного или животного происхождения. Перед использованием смесь праймеров размораживают в
твердотельном термостате с охлаждением при температуре 4 "С, перемешивают на микроцентрифу-
ге-встряхивателе в течение от 5 до 10 с, а затем собирают осаждением на дно микропробирки путем
центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение от 3 до 5 с. Последующую работу с
праймерами рекомендуется проводить при температуре от 2 °С до 4 °С с использованием твердотель
ного термостата с охлаждением.
7.3.3 В микропробирку с ПЦР-смесъю для К- вносят 5 мкл ТЕ-буфера, подготовленного по 6.2.12.
Затем в микропробирки с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) добавляют по 5 мкл экстракта
ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь в микро
пробирку с ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+, который входит в
состав набора реагентов. Содержимое пробирок растворяют путем легкого перемешивания на микро
центрифуге-встряхивателе. После этого собирают осаждением капли ПЦР-смеси со стенок пробирок
путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение от 3 до 5 с.
7.3.4 Если конструкция используемой модели амплификатора требует проведения ПЦР в специ
альных пробирках-контейнерах, то полученное после растворения и перемешивания содержимое про
бирокдля амплификации полностью переносят в такие контейнеры.
7.3.5 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют в течение от 5до 7 с на микроцентрифуге-
встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения амплификации по про
граммам. указанным в таблицах 3 и 4.
Т аб лиц а 3 — Программа амплификации (качественного определения) фрагментов видоспецифичной расти
тельной ДНК (сои. кукурузы, картофеля) в режиме реального времени
Этап
программы
Режим амплификации
ПроцессЧисло
ЦИКЛОВ
температура, *Свремя, с
194180Денатурация ДНК1
94
30
Денатурация ДНК
27030Отжиг праймеров40
7230*Синтез ДНК
* Включение оптики для детекции ПЦР — продуктов (в реальном времени): канал для красителей FAM
и SYBR Green (оптимальная длина волны источника света — 494 нм. оптимальная длина волны для детекции
флуоресценции красителя — 518 нм).
П р и м е ч а н и е — Использование амллификаторое различных моделей может потребовать изменения
температуры отжига праймеров на 1 "С — 2 "С.
10