ГОСТ 31719—2012
6.2.8 Повторяют операции, изложенные в 6.2.6. В последний раз надосадочную жидкость удаляют
как можно более полно, не задевая при этом осадка.
6.2.9 Микропробирку открывают, осадок сушат в термостате в течение от 5 до 7 мин при темпера
туре 65 °С. К высушенному осадку добавляют 75 мкл ТЕ-буфера. перемешивают содержимое микро
пробирки на микроцентрифуге-встряхивателе до получения однородной суспензии и термостатируют в
течение 10 мин при температуре 65 °С. (Если осадок сорбента сразу не суспендируется,
микропробирку помещают в термостат на 2—3 мин. после чего вновь перемешивают).
6.2.10 Содержимое микропробирки повторно перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе
и центрифугируют на высокоскоростной центрифуге в течение 2 мин при 10000 об/мин.
6.2.11 Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) переносят в чистую микропробирку, не задевая при
этом осадка, поскольку попадание в нее сорбента может в дальнейшем приводить к ингибированию
ПЦР.
6.2.12 Полученный экстракт ДНК передают на этап проведения амплификации и при необходи
мости хранят при температуре 4 °С в течение 1 мес или при температуре минус 18 °С до одного года.
6.2.13 В чистую микропробирку отбирают от 30 до 80 мкл ТЕ-буфера и передают на этап проведе
ния амплификации для постановки контролей амплификации.
7 Амплификация фрагментов видоспецифичной ДНК растений
и животных
Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК растений иживотных используют наборы реа
гентов для ПЦР. содержащие праймеры, специфичные к ДНК определенного вида растений или живот
ных. При проведении анализа в ПЦР-лаборатории соблюдают меры предосторожности в соответствии с
приложением А.
7.1 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных
с использованием наборов роагентов для ПЦР с жидкими праймерами
7.1.1 В штативе размещают и маркируют необходимое число микропробирок с лиофильно вы
сушенной амплификационной смесью по числу анализируемых проб, включая пробирки для положи
тельного и отрицательного контролей. В случае исследования многокомпонентных продуктов число
микропробирок на одну пробу, а также число микропробирок для отрицательных и положительных кон
трольных образцов рассчитывается исходя из того, какое число видов ДНК планируется идентифици
ровать.
7.1.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью при помощи автоматического дозатора после
довательно вносят 10 мкл ПЦР-растворителя и 5 мкл смеси праймеров для выявления конкретного
фрагмента видоспецифичной ДНК того или иного компонента растительного или животного проис
хождения. Перед использованием смесь праймеров необходимо разморозить в твердотельном тер
мостате с охлаждением при температуре 4 °С. перемешать на микроцентрифуге-встряхивателе в
течение от 5 до 10 с. а затем собрать осаждением на дно микропробирки путем центрифугирования на
микроцентрифуге-встряхивателе в течение от 3 до 5 с. Последующую работу с праймерами реко
мендуется проводить при температуре от 2 X до 4 °С с использованием твердотельного термостата с
охлаждением.
7.1.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного контрольного образца вносят 5 мкл
ТЕ-буфера. подготовленного по 6.2.12. Затем в микропробирки с ПЦР-смесью добавляют по 5 мкл экс
тракта ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь в
микропробирку с ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+ из использу
емого набора реагентов для проведения ПЦР.
7.1.4 Содержимое микропробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифу
ге-встряхивателе. После этого собирают осаждением капли ПЦР-смеси со стенок микропробирок путем
центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 3—5 с.
7.1.5 Если для проведения амплификации используется амплификатор без нагреваемой крышки,
то в каждую микропробирку добавляют по 20—25 мкл (две капли) минерального масла.
7.1.6 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют в течение от 5до 7 с на микроцентрифуге-
встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения амплификации по про
граммам. указанным в таблицах 1 и 2.
8