ГОСТ 31719—2012
Т аб лиц а 4 — Программа амплификации (качественного определения) фрагментов видоспецифичной ДНК жи
вотных (крупного рогатого скота, свиньи, курицы) в режиме реального времени
Этап протраммы
Режим амплификации
Процесс
Число циклоп
температура. ’С
оремя. с
1
94
180
Денатурация ДНК
1
2
94
30
Денатурация ДНК
40
62 — для крупного рогатого скота
65 — для свиньи
66 — для курицы
30
Отжиг праймеров
72
30’
Синтез ДНК
• Включение оптики для детекции ПЦР — продуктов (в реальном времени): канал для красителей РАМ
и SYBR Green (оптимальная длина волны источника света — 494 нм. оптимальная длина волны для детекции
флуоресценции красителя — 518 нм).
П р и м е ч а н и е — Использование амплификаторое различных моделей может потребовать изменения
температуры отжига праймеров на 1 *С — 2 ’С.
7.3.6Проводят детекцию продуктов ПЦР в соответствии с описанием к используемой модели ам-
плификатора (для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени).
7.4 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК животных
с использованием наборов реагентов для проведения ПЦР с детекцией в режиме
реального времени
7.4.1 В штативе размещают и маркируют необходимое количество микропробирок с лиофильно
высушенной амплификационной смесью (для ПЦР в реальном времени) по количеству анализируемых
проб, а также микропробирки для К- и К+. В случае исследования многокомпонентных продуктов число
микропробирок на одну пробу, а также число микропробирокдля К- и К+ рассчитывается исходя из того,
какое количество видов ДНК планируется идентифицировать.
7.4.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) при помощи автома
тического дозатора последовательно вносят 10 мкл ПЦР-растворителя, 5 мкл стерильной дистиллиро
ванной воды. 5 мкл смеси праймеров и зонда для выявления конкретного фрагмента видоспецифичной
ДНК того или иного компонента животного происхождения. Перед использованием смесь праймеров
размораживают в твердотельном термостате с охлаждением при температуре 4 °С. перемешивают на
микроцентрифуге-встряхиватсле в течение от 5 до 10 с. а затем собирают осаждением на дно микро
пробирки путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение от 3 до 5 с. После
дующую работус праймерами проводят при температуре от 2 вС до 4 °С с использованием твердотель
ного термостата с охлаждением.
7.4.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного контрольного образца вносят 5 мкл
К-. Затем в микропробирки с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) добавляют по 5 мкл экс
тракта ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь
в микропробирку с ПЦР смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+.
Содержимое пробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-встряхивателе.
После этого собирают осаждением ПЦР — смесь со стенок пробирок путем центрифугирования на
микроцентрифу ге-встряхивателе в течение от 3 до 5 с.
7.4.4 Если конструкция используемой модели амплификатора требует проведения ПЦР в специ
альных пробирках-контейнерах, то полученное после растворения и перемешивания содержимое про
бирок для амплификации полностью переносят в такие контейнеры.
7.4.5 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют в течение от 5 до 7 с на микроцентрифу
ге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения ПЦР по программе,
указанной в таблице 5.
11