ГОСТ 30425-97
Г.2.1 Путем микроскопирования устанавливают морфологию клеток, наличие и тип спор, присутствие
глобул в бациллярных клетках, способность бактерий окрашиваться по Граму. Микросконируют мазки, окра
шенные фуксином и (или) малахитовой зеленью и сафранином, и (или) окрашенные но Граму, и (или)
препараты живых микроорганизмов способом фазового контраста. Для установления принадлежности к группе
B.ccreus определяют присутствие в бациллярных клетках глобул в препаратах, приготовленных из посевов на
мясо-пептонпом агаре, содержащем 0.1
%
глюкозы. Присутствие спорообразуюших бактерий устанавливают в
препаратах культур любого возраста, отсутствие — по результатам просмотра пятидневной культуры. Для ок
раски но Граму используют посевы микроорганизмов не старше 24-часового возраста.
Г.2.2 Для приготовления мазков суспензию микроорганизмов бактериологической петлей наносят на
обезжиренное предметное стекло, распределяют тонким споем на площади около 1 см2, высушивают на
воздухе и фиксируют.Для фиксации предметное стекло захватывают пинцетом и три раза проводят над верхней
частью нскоитяшего пламени мазком вверх. На остывший хгнзок через полоску фильтровальной бумаги нано сят
красящий раствор.
Г.2.3 Для выявления глобул в бациллярных клетках мазки окрашивают раствором фуксина, приготов
ленным по ГОСТ 10444.1. Клетки бацилл группы B.ccreus, выращенные на агаре с глюкозой, заполнены нео
крашенными глобулами на фоне окрашенной протоплазмы.
Г.2.4 Д|я окраски по Граму в модификации Хукера мазки окрашивают раствором кристаллического фи
олетового с шавсле во кислым аммонием. Через 0,5—1,0 мин с окрашенного мазка удаляют бумагу и избыток
красителей, мазок промывают пропятой водой, наносяг на него йодный раствор по Бурке. Спустя 0.5—
1.0 мин мазок промывают 96 %-ным этиловым спиртом, погружая его последовательно в несколько порций
спирта до тех пор. пока с мазка нс будут стекать окрашенные струйки. Затем с мазка удаляют остатки спирта,
промывая его водой. Промытый мазок окрашивают красителем контрастного цвета, выдерживая 2—3 мин в
растворе сафранина, затем промывают водой и высушивают. Грамположигсльные микроорганизмы образуют с
основным красителем стойкое соединение, то ссгь окрашиваются в сине-фиолетовый цвет основ ного
красителя. Грамотриизгельные микроорганизмы теряют основной краситель и приобретают красный цвет
контрастного красителя. Допускается окрашивать мазок 1 %-ным водным раствором кристаллического
фиолетового, метилового фиолетового или генцианвиол ста и после закрепления краски йодным раствором по
Бурке промывать препарат ацетоном и докрашивать 0,5 %-ным водным раствором сафранина или спиртовым
раствором фуксина. Растворы для окрашивания препаратов готовят по ГОСТ 10444.1.
При микроскопированнк споры, которые нс окрашиваются фуксином или по Граму. хорошо видны на
фоне окрашенной протоплазмы.
Г.2.5
Для
обнаружения бактериальных спор в мазках при микроскопировании с фазовоконтрастным
устройством приготавливают препарат на голодном агаре. Горячий раствор голодного агара наносяг пипеткой на
чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло, которое для получения на нем тонкой, равномерной
пленки агара быстро поворачивают на ребро, давая стечь избытку раствори. На застывшую пленку голодного
агара бактериологической петлей наносят каплю культуральной жидкости, накрывают ее покровным стеклом
выпуклой стороной вверх и слегка прижимают его к поверхности предметного стекла. При микроскопирова-
нии бактериальные непроросшие споры выглядят как отдельно расположенные или внутриклеточные блестя-
шис. хорошо преломляющие свез образования, проросшие споры выглядят тусклыми или темными образо
ваниями.
Г.2.6 Ятя окраски спор па мазок наносят раствор малахитовой зелени, приготовленный по ГОСТ 10444.1.
и нагревают его в течение 1 мин до появления паров жидкости, после охлаждения промывают водой, затем
докрашивают в течение 30 Сраствором сафранина или фуксина, вновь промывают водой и
микросконируют. Бактериальные споры окрашиваются в зеленый, вегетативные клетки — в красный цвет.
Г.2.7 Мазки, приготовленные по Г.2.3—Г.2.6. микросконируют с использованием масляной иммерсии
при увеличении 900—1000х.
Г.З Определение присутствия в посевах анаэробных микроорганизмов
Присутствие в посевах анаэробных микроорганизмов определяют путем высева одной-двух капель куль
туральной жидкости и (или) ее разведений одним из способов, указанных ниже.
Г.З. 1 Культуральную жидкость и (или) ее разведения переносят в чашки Петри (отдельные для культу
ральной жидкости и каждого ее разведения). Посевы в чашках Петри заливают агаризованной питательной
средой для аэробных, факультативно-анаэробных или анаэробных микроорганизмов, приготовленных по
ГОСТ 10444.1. Посевной материал к среду тщательно перемешивают. Чашки помешают ванаэростат или герме
тичную камеру, удаляют из них кислород, создавая анаэробные условия культивирования. Рост микроорганиз
мов контролирую! через 24—48 ч. Анаэробные микроорганизмы образуют в анаэробных условиях колонии,
характерные для роста в использованной питательной среде.
Г.3.2 На застывшую поверхность питательной среды посевов, проведенных анатогично указаниям Г.З. 1 и
с учетом того, что слой посевного материала с питательной средой в чашках Петри должен быть нс менее
0.8 см. пинцетом помешают стерильное предметное стекло так. чтобы под стеклом не было пузырьков возду ха.
Чашки Петри в перевернутом виде тсрмостатнруюг нс в анаэробных условиях при температуре (30± 1) ‘С. Рост
микроорганизмов контролируют через 24—48 ч. Анаэробные микроорганизмы растут наиболее
12
268