ГОСТР ИСО 29701— 2015
7.2 Альтернативные методы испытаний
7.2.1 Сущ ность ф отометрических методов по конечной точке
В фотометрических методах по конечной точке измеряют оптическую плотность (ОП) испытуемых
растворов к концу инкубационного периода. Фотометрические методы подразделяют на хромогенный
метод по конечной точке и турбидиметрический метод по конечной точке. Хромогенный метод по конеч ной
точке основан на количественной зависимости концентрации эндотоксинов от количества хромо фора.
п-нитроанилина (p-NA), высвободившегося из хромогенного субстрата Boc-Leu-Gly-Arg-p-NA или Boc-
Thr-Gly-Arg-p-NA к концу инкубационного периода. Турбидиметрический метод по конечной точке
основан на количественной зависимости концентрации эндотоксинов от степени мутности (поглощение
или пропускание) испытуемого раствора в конце инкубационного периода. Недостатками турбидиме-
трического метода по конечной точке являются низкая чувствительность и сложность остановки реак ции
в заданный момент времени. Поэтому для определения концентрации эндотоксинов в наноматери алах
целесообразнее использовать турбидиметрический кинетический метод (см. 7.2.2). Значение ОП p-NA
в испытуемых растворах измеряют при длине волны 405 нм. Интенсивность окраски испытуемых
растворов в пурпурный цвет диазотированным производным p-NA измеряют при длине волны от 540 до
550 нм.
Чувствительность фотометрических методов по конечной точке с использованием готовых реак
тивов при измерении значений ОП p-NA при длине волны 405 нм составляет 0,01 ЕЭ/мл. при измере нии
интенсивности окраски испытуемых растворов в пурпурный цвет диазотированным производным p-NA —
0.001 ЕЭ/мл.
П р и м е ч а н и е — Описание фотометрического метода по конечной точке (хромогенного метода по конеч
ной точке) приведено в приложении С.
7.2.2 Сущность кинетических методов
Кинетические методы подразделяют на турбидиметрический кинетический метод и хромогенный
кинетический метод. В процессе испытаний кинетическими методами измеряют время, необходимое
для достижения заданного значения ОП. или степени мутности, или скорость окрашивания испытуемых
растворов. Измерения выполняют спектрофотометром или микропланшетным фотометром. Значения
ОП p-NA. или скорость окрашивания, или степень мутности испытуемых растворов в ходе испытаний
регистрируют несколько раз через заданные интервалы времени. Для определения концентрации эн
дотоксинов в наноматериале применяют измерительные системы, с помощью которых можно одно
временно инкубировать испытуемые растворы, измерять ОП и выполнять обработку результатов. Чув
ствительность кинетических методов с применением измерительных систем составляет 0,001 ЕЭ/мл.
П р и м е ч а н и е — Описание кинетических методов приведено в приложении D.
7.3Вы бор метода испытаний и ф акторы, влияющ ие на достоверность результатов
испытаний
7.3.1 М инимальное значение чувствительности ЛАЛ-теста
В программах и методиках испытаний устанавливают минимальное значение чувствительности
ЛАЛ-теста, которое должно быть на уровне или выше предельно допустимого значения концентрации
эндотоксинов в наноматериале, установленного для испытаний с использованием конкретной тест-
системы
in vitro.
Предельно допустимое значение концентрации эндотоксинов в наноматериале уста
навливают с целью обеспечения при испытании в тест-системах
in vitro
протекания необходимых био
логических реакций и в зависимости от требований, предъявляемых к испытаниям с использованием
конкретной тест-системы
in vitro.
Например, эндотоксины концентрацией 0.01 нг/мл вызывают в макро
фагах человека образование цитокинов IL-1P и TNF-a (13), а эндотоксины концентрацией 0.048 нг/мл
вызывают только незначительные биологические реакции в дендритных или мононуклеарных клетках
периферической крови человека (13).
Выбор метода для проведения ЛАЛ-теста осуществляют с учетом предельно допустимого значе
ния концентрации эндотоксинов в наноматериале, установленного для испытаний с использованием
конкретной тест-системы
in vitro.
7.3.2 Мешающие ф акторы
7.3.2.1В некоторых наноматериалах определить количественную концентрацию эндотоксинов
ЛАЛ-тестом невозможно вследствие наличия мешающих факторов, оказывающих влияние на ингиби
рование (замедление) или активацию (усиление) реакции ЛАЛ-реактива с эндотоксинами (И/А).
5