ГОСТ ISO 11930—2014
Исходная культура - это конфлюэнтная культура, полученная путем посева культуры из храни
лища штрихом на пробирки со скошенным агаром или на чашки Петри с помощью одноразового ша
рика. После инкубации исходная культура может храниться при температуре от 2 еС до 8 вС до двух
месяцев и применяться для получения рабочих культур.
Из рабочей культуры, которую готовят непосредственно перед экспериментом, получают ка
либрованную суспензию (инокулят).
Исходную и рабочую культуры выращивают в одинаковых условиях инкубирования на одинако
вой питательной среде (см. 5.4.2 и 5.4.3).
П р и м е ч а н и е 1 - Ограничение количества последовательных пересевов и использование конфлю
энтных культур, а не изолированных колоний, снижает риск изменения восприимчивости штаммов. Стандартиза
ция условий созревания и подготовки инокулята повышает воспроизводимость метода.
П р и м е ч а н и е 2 - Использование многоразовой посуды, которую хранят в замороженном виде, мо
жет привести к изменению восприимчивости штаммов, вызванному действием тепловых ударов. Это может про
изойти. если посуду вынимают из морозильного шкафа, из нее извлекают один шарик, а затем посуду возвра
щают в шкаф.
5.4.2 Подготовка суспензий бактерий и Candidaalbicans
5.4.2.1 Для подготовки рабочей культуры испытуемого микроорганизма необходимо подгото
вить субкультуру путем посева исходной культуры штрихом на пробирки со скошенным агаром или на
чашки Петри (TSA для бактерий. SDA для C.albicans). чтобы получить конфлюэнтную культуру. Вы
ращивают при температуре (32.5 ± 2.5) °С в течение 18 - 24ч.
Таким же образом готовят вторую субкультуру путем посева первой культуры и выращивают
при температуре (32.5 ± 2.5) еС в течение 18 - 24 ч. Третью субкультуру можно вырастить таким же
способом путем посева второй культуры. Вторая культура и третья (если она была выращена) обра
зуют рабочую культуру.
Если нельзя получить вторую субкультуру своевременно, тогда допускается выдерживать
первую культуру до 48 ч в инкубаторе при температуре (32,5 ± 2.5) °С. а затем использовать ее для
подготовки второй субкультуры. В этом случае готовят третью субкультуру в течение 18 - 24 ч и ис
пользуют ее в испытании.
Не рекомендуется готовить четвертую субкультуру из исходной культуры.
5.4.2.2 Берут 10 см3разбавителя (см. 5.2.2.2) и помещают в подходящую стерильную посуду со
стерильными стеклянными шариками массой около 5 г. Переносят клетки, выращенные в агаризован-
ной среде, в разбавитель с помощью петель для посева. Клетки суспендируют в разбавителе, поте рев
петлю с небольшим количеством разбавителя о стенку посуды, чтобы отделить клетки.
5.4.2.3 Гомогенизируют суспензию, встряхивая посуду вручную или механическим способом в
течение 3 мин. Отбирают верхнюю часть суспензии с помощью аспиратора (избегая контакта со стек
лянными шариками) и переносят полученную суспензию в стерильную посуду.
5.4.2.4 Регулируют концентрацию клеток в суспензии с помощью растворителя (см. Ъ.2.2.2) со
гласно данным о калибровке, полученным в лаборатории (например, с помощью спектрофотометра,
см. ISO 21148, приложение С). Концентрация должна составлять от 1 * 107 КОЕ/см3до 1 * 10s
КОЕ/см3 для бактерий и от 1 * 106КОЕ/см5до 1 * 107 КОЕ/см1для С. albicans.
Калиброванный раствор используют в течение двух часов.
5.4.2.5 При выполнении эксперимента проверяют исходную концентрацию клеток в суспензии.
N. Выполняют серию десятикратных разведений калиброванной суспензии с помощью растворителя
(см. 5 2.2.2). Выполняют подсчет количества клеток путем переноса 1 см3подходящих растворов (см.
5.6.2) в среду TSA для бактерий и SDA для C.albicans. Выращивают при температуре (32.5 ± 2.5) °С в
течение 24 - 48 ч.
5.4.3 Подготовка взвеси спор A. brasiliensis (устаревшее название A. niger)
5.4.3.1 Для получения рабочей культуры тест-микроорганизма готовят суспензию клеток исход
ной культуры (на PDA) не старше двух месяцев в растворителе (см. 5 2.2.2). Выполняют посев, залив
суспензию на поверхность среды PDA. помещенной в колбу или подходящее количество чашек Пет
ри. чтобы получить конфлюэнтную культуру. Выращивают при температуре (22.5 ± 2.5) °С в течение
7-11 дней.
5.4.3.2 После выращивания переносят 10 см3раствора полисорбата 80 (см. 5.2.2.2.3) в колбу.
Осторожно отделяют споры от поверхности культуры, используя лопатку или стеклянные шарики.
Переносят суспензию в подходящую колбу и осторожно перемешивают со стеклянными шари
ками в течение примерно 1 мин. Фильтруют суспензию с помощью фильтра из пористого стекла с по
ристостью 2 (от 40 до 100 мкм).
5.4.3.3 Выполняют микроскопирование (увеличение *400), чтобы установить наличие пророс
ших спор или фрагментов мицелия.
6