ГОСТ 32368—2013
(100 мг/л). Правильно примененная анестезия позволяет различить сердцебиение данио рерио. Проделывая сер
дце. держат поршень шприца под небольшим давлением. Собираемые объемы кровисоставляют20—40 мкл. Пос ле
пункции сердца кровыбуферная смесь должна быть перенесена в пробирку. Плазму отделяют от крови
центрифугированием (20 мин: 5000 д). и хранят при температуре минус 80 ‘Сдо проведения анализа.
F.7 Процедура ЗС: стандартная операционная процедура: данио рерио. гомогенизация головы и
хвоста
F.7.1 Рыбы подвергнуты анестезии и эвтаназии в соответствии с описанием в тексте.
F.7.2 Головуи хвост рыбы отрезают в соответствии с рисунком F.9.
Важно: все инструменты для вскрытия, так же как и препарационный стол, должны быть вымыты и
очищены должным образом [например. 96 %-ным этиловым спиртом) между обработкой каждой конкретной
рыбы, чтобы предотвратить кзаарязнение вителлогенином» от самок или чтобы индуцированные самцы не
язагрязнили» интактных самцов.
На анализ
На анализ в ТГНа гистологию гонадв ТГ
Разрезпозади
спинного плавника
Разрез позади
грудного плавника
РисунокF.9
F.7.3 Общий вес головы и хвоста каждой рыбы взвешивают сточностью до миллиграмма.
F.7.4 Послевзвешиваниячасти помещаютв соответствующиепробирки (например. Эппендорфа на 1.5 мл) и
замораживают при температуре минус 80 ‘Сдо момента гомогенизации или сразу гомогенизируют на льду с двумя
пластиковыми пестиками. (Могут быть использованы другие методы, если их проводят на льду и они дают резуль тат
— однородную массу). Важно: пробиркидолжны быть пронумерованытак. чтобыголова ихвост моглибыть
связаны с соответствующей частью тела, используемой для гистологии гонад.
F.7.5 Для получения однородной массы добавляют ледяной гомогенизационный буфер11 в количестве
четырех от измеренного веса ткани. Продолжают работать с пестиками, пока смесь не станет гомогенной.
Важное замечание:ислольэуют новые пестики для каждойрыбы.
F.7.6 Образцы помещают в леддо центрифугирования при температуре 4 ’С при 50000 g атечение 30 мин.
F.7.7 Используют пипеткудля забора 20 мкл супернатанта по крайней мере в двух пробирках, опуская конец
пипетки ниже плотного слоя на поверхности и тщательно собирая супернатант без жира или частиц ткани.
F.7.8 Пробирки хранят при температуре минус 80 ‘Сдо использования.
1 Гомогенизационный буфер. (50 ммоль трис-НС1с pH 7.4; 1 % смеси ингибиторов протеаз (Сигма)]: 12 мл
трис-HCI с pH 7,4 »120 мкл смеси ингибиторов протеаз. ТРИС. ТРИС-УЛЫРА ЧИСТЫЙ (ICN) например, произво
дства Bie&Berntsen (Danemark). Смесь ингибиторов протеаз, производства Sigma (из тканей животных). Номер про
дукта Р 8340 ВАЖНО. Гомогенизационный раствор используется в день приготовления. Держите раствор на льду
во время использования.
27