ГОСТ 32368—2013
4 Вынимаютпилон из микропробирки иоставляют еепокое приблизительнона 10секунд. Затем осуществля
ют визуальную проверку состояния суспензии.
5 Если в суспензии наблюдаются частички печени, повторяют операции 3 и 4, чтобы подготовить однород
ный гомогенат печени.
6 Охлаждают суспендированный гомогенат печени на льду перед центрифугированием.
7 Заменяют пилон на новый для каждого гомогенироаания.
8 Гомогенизируют всю печень с гомогематным буфером согласно процедуре, описанной выше.
F.4.2.3 Центрифугирование суспендированного гомогената печени
1 Устанавливают температуру охлаждающей камеры центрифуги не менее 5 ‘С.
2 Вставляют микропробирки на 1.S мл. содержащие суспендированный гомогенат печени в охлаждающую
центрифугу (отрегулируйте баланс а случае необходимости).
3 Центрифугируют суспендированный гомогенат печени при 13 000 g а течение 10 минут при температуре
не менее 5 SC. Однако, если супернатант корректно отделился, центробежная сила и время центрифугирования
могут быть соответственно скорректированы.
4 После центрифугирования проверяют, что супернатант качественно отделился (на поверхности: липиды,
промежуточные, супернатант, осадок: ткани печени). Если разделение некачественное, центрифугируют суспен
зию снова при тех же самых условиях.
5 Удаляют всеобразцы для испытания из охлаждающей центрифуги иустанавливают их в емкости со льдом
в порядке проведения испытания. Стараются не взболтать пробирки.
F.4.2.4 Сбор супернатанта
1 Помещают четыре микропробирки на 0,5 мп в штатив для хранения супернатанта.
2 Берут 30 мкл каждого супернатанта (сформированного как промежуточный слой)микропипеткой и собира
ют его в одной микропробирке на 0,5 мл. Стараются не собиратьлипиды с поверхности или ткани печени в осадке.
3 Собирают супернатант и распределяют его на две другие микропробирки на 0.5 мл тем же способом как
описано выше.
4 Собирают остальную частьсупернатанта микропипеткой (если возможно: не более 100 рL). Распределяют
супернатант на оставшиеся микропробирки на 0.5 мп. Старатся не собирать липиды споверхности или ткани печени в
осадке
5 Закрывают колпак микропробирки на 0,5 мл и записывают объем супернатанта на ярлыке. Затем немед
ленно охлаждают микропробирки на льду.
6 Заменяют наконечник микропипетки на новыйдля каждого образца супернатанта. Если кнаконечникупри
липает большое количество липидов немедленно заменяют наконечник, чтобы избежать загрязнения экстракта
печени жиром.
7 Распределяютвесь центрифугируемый супернатант на четыре микропробиркипо 0.5млсогласно процеду
ре. описанной выше.
8 После распределения супернатанта на микропробирки по 0.5 мл. помещают их в штатив с идентифициру
ющими этикетками и затем немедленно замораживают в морозильнике. Если концентрации VTQ измеряют
непосредственно после предварительной обработки, держат одну микропробирку на 0.5 мл (содержащей 30 мкл
супернатанта) в охлаждающем штативе и передают его на рабочее место для проведения анализ ELISA. В этом
случае помещают оставшиеся микропробирки в штатив и замораживают их в морозильнике.
9 После сбора супернатанта, утилизируют остаток в соответствии с принятой процедурой.
F.4.2.5 Хранение испытательных образцов.
Хранят микропробирки на 0.5 мп. содержащие супернатант гомогената печени при температуре менее
минус 70вС, до проведения анализа ELISA.
F.5 Процедура ЗА: данио рерио, сбор крови из хвостовой артерии/вены
Незамедлительно после анестезии делают рассечение возле хвоста и кровь из хвостовой артерии/вены
собирают амикрогематокритные капиллярные трубки с гепарином. Объемы крови колеблются от 5до 15 микролит-
рое в зависимости от размера рыбы. Равный объем буфера апротинина (6 мкг/мл в фосфатном буферном растворе
(ФБР))добавляют в микрокапиллярные трубки и отделяют плазмуот крови центрифугированием (5 мин при 600 д).
Плазму собирают в пробирки и хранят при температуре минус 20 °С до проведения анализа на вителлогенин или
другие белки.
F.6 Процедура ЗВ: данио рерио,сбор крови пункцией сердца
Чтобы избежать коагуляции крови и разложения белка, образцы собирают в фосфатный буферный раствор,
содержащий гепарин (1000 ед/мл)и ингибитор протеазы апротинин (2ТШ/мл).Для приготовления буфера рекомен
дуются гепарин, соль аммония и лиофилизированный апротинин. Для забора крови рекомендуется шприц (1 мл) с
неподвижной тонкой иглой (например. Braun Omnlkan-F). Шприц должен быть предварительно наполнен буфером
(приблизительно 100 мкл), чтобы полностью элюировать малые объемы крови от каждой рыбы. Образцы крови
берутся проколом сердца. Рыба вначале должна быть анестезирована MS 222 (трикаин метанесульфонат)
26