ГОСТ 32368—2013
представителей другого пола; например, антагонисты рецепторов андрогена, такие, как тренболон,
метилтестостерон и дигидротестостерон, могут привести к развитию у самок толстоголового гольяна
брачных бугорков или появлению папиллярных полос у самок японской медаки. Также было отмечено,
чтоантагонисты рецепторовэстрогенамогутпривести куменьшениючисла брачныхбугорковиразмера
затылочной подушки у взрослых самцов. Такие морфологические наблюдения могут предоставить
полезную качественную иколичественную информацию при планированиидальнейших исследований.
Число и размерсвадебныхбугорков у гольяна ипапиллярные бугорки у медаки могутбытьопределены
количественно непосредственно или позднее в сохраненных образцах.
5.4.6 Вителлогенин (VTG)
5.4.6.1 Кровьсобираютухвостовойартерии/вены капиллярной трубочкойс гепарином спомощью
микрогематокрита илишприцем пункциейсердца. В зависимостиот размерарыбкисобираемыеобъемы
крови колеблются от 5 до 60 мкл для толстоголового гольяна и 5—15 мкл для данио рерио. Плазму
отделяют от крови центрифугированием и хранятс ингибиторами протеазы при минус 80 °Сдо анализа
на вителлогенин. У медакидля анализа используются печень, уданио рериотакже можно использовать
как источниктканидля анализа вителогенина гомогенат головы/хвоста. ИзмерениеVTG следуетпрово
дитьпо утвержденному гомологическомуметоду ELISAс использованием гомологическихстандартов и
антител VTG. Рекомендуется использовать метод, способный обнаружить VTG в плазме на уровне
нескольких нанограмм/милллиметр плазмы(нг/мл ткани), который является фоновым уровнем для
интактныхсамцов рыб.
5.4.6.2 Контроль качества анализа вителлогенина достигается с помощью стандартных наборов
химикатов и дублированием анализа. Для каждого метода ELISA строят матричный эффект (эффект
разбавления пробы) для определения минимального фактора разбавления. Каждая пластина ELISA,
используемая для анализа VTG. должна включать следующие контрольные образцы: по крайней мере
шесть стандартных калибровочных растворов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций
вителлогенина. и по крайней мере один холостой опыт (проанализированный в двух повторностях).
Степень поглощения света в холостых пробахдолжна составить менее чем 5 % максимальной абсорб
ции стандартного калибровочного раствора. Будутпроанализированы по крайней мере два определен
ных количества (абсолютно одинаковых) каждого типового разбавления. В случав разброса между
повторностями болеечем на 20 %анализ повторяют.
5.4.6.3 Коэффициент корреляции (/?2) для калибровочных кривых должен быть больше 0.99.
Высокая степень корреляции недостаточна для того, чтобы гарантировать адекватное предсказание
концентрации во всех диапазонах. В дополнение к наличию достаточно высокой корреляции значений
калибровочной кривой к концентрации каждого стандарта вычисляют кривую стандартных растворов,
которая должна находиться между 70 % и 120 % ее номинальной концентрации. Если номинальная
концентрация расположена далеко от линии регрессии калибровочного графика (например, при более
низких концентрациях), это может привести к необходимости разбить калибровочную кривую в низком и
высоком диапазонах или к применению нелинейной модели, чтобы соответственно удовлетворить
полученные результаты абсорбции. Если кривая разбита, каждый ее сегментдолжен иметь R2>0.99.
5.4.6.4 Предел обнаружения (LOD) обозначается как концентрация наименьшего аналитического
стандарта, предел количественного определения (LOQ) понимают как наименьшую концентрацию
наименьшего стандарта, умноженную на самый низкий фактор разбавления.
5.4.6.5 В день выполнения анализа на вителлогенин, проводят анализ усиленного образца
стандартного раствора (приложение 3). Также систематически сверяютотношения междуожидаемой и
измеренной концентрацией, выполненной в тот же день.
5.4.7 Оценка гонадальной гистопатологии
Гонады фиксируются либо сохраняется все тело или его части. Когда требуется гистопатология,
специфические эндокринно-связанные ответы на гонады будут искать в оценке эндокринной деятель
ности исследуемого вещества. Эти диагностические результаты по существу включают наличие яичек
ооцитов, гиперплазию клеток Лейдига. снижение образования желтка, увеличение сперматогонии и
околофолликулярную гиперплазию. Другие половые поражения, такие какатрезия яйцеклетки, дегене
рация яичек, и другие стадии изменения могут иметь различные причины. Руководящий документ по
гистопатологиигонадрыбсодержитпроцедуры, которые используются привскрытии, фиксации, секцио
нировании и гистолатологическихоценках гонады.
7