ГОСТ 32368—2013
Приложение F
(рекомендуемое)
Рекомендуемы© процедуры для типового определения содержания вителлогенина
Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами VTG
самцов и самок.
F.1 Процедура 1А: толстоголовый гольян, забор крови из хвостовой вены/артерии
После анестезии хвостовую часть надрезают скальпелем и собирают кровь из хвостовой вены/артерии с
помощью капиллярной пипетки гепариновым микрогематокритом. После того как кровь собрана, быстро отделяют
плазму центрифугированием в течение 3 мин при 15 000 g (или альтернативно 10 мин при 15 000 g при 4 ‘С).
Процент гематокрита а конечном итоге может быть определен после центрифугирования. Затем плазму удаляют
пипеткойсмикрогематокритом ихранятв пробирке центрифуги с 0,13 единицами апротинина (ингибиторпротеазы)
при минус 80 ‘С. до анализа вителлогенина. В зависимости от размера толстоголового гольяна (который зависит
от пола) собранные объемы плазмы колеблются от 5до 60 мкл на рыбу (Jensen идр.. 2001).
F.2 Процедура 1В: толстоголовый гольян, сбор крови пункцией сердца
Альтернативно кровь может быть также собрана проколом сердца с помощью гепаринизированного шприца
(1000 единиц гепарина на мл). Кровь переносят в пробирки Эппендорфа (выдержанные на льду) и затем центри
фугируют (5 мин. 7 000 д. при комнатной температуре). Плазму переливают в чистые пробирки
Эппендорфа (аликвотно. если объем плазмы это позволяет) и быстро замораживают при минус 80 “С, до
проведения анализа (Panteum и др.. 1998).
F.3 Процедура 2А: японская медака. удаление печени
F.3.1 Удаление тестируемой рыбы из испытательной камеры
1 Тестируемая рыба должна быть удалена из испытательной камеры с использованием сачка с мелкой
сеткой. С осторожностью выпускают тестируемую рыбу в другие испытательные камеры.
2 В принципе тестируемые рыбы должны быть удалены в следующем заказе, контроль, контроль раствори
теля (если необходимо), самая низкая концентрация, средняя концентрация, самая высокая концентрация и поло
жительный контроль. Кроме того, все самцы должны быть удалены из испытательной камеры раньше самок.
3 Пол каждой тестируемой рыбы идентифицируют по внешним вторичным половым признакам (например,
по форме анального плавника).
4 Поместите тестируемую рыбу в контейнер для транспортировки и переносят на рабочее место для уда
ления печени. Проверяют этикетки тестовых аквариумов и транспортного контейнера для точности и убеждаются,
что количество рыб. которые были удалены из тестового аквариума, и количество выловленных рыб совпадают.
5 Если пол не может быть идентифицирован по внешнему виду рыбы, удаляют всю рыбу из тестового аква
риума. В этом случае пол должен быть идентифицирован по анализу гонад или вторичным половым признакам под
бинокулярным микроскопом
F.3.2 Удаление печени
1 Переносят тестируемую рыбу из транспортного контейнера в анестезирующий раствор, используя сачок с
мелкой сеткой.
2 После того как тестируемая рыба обезболена, перекладывают ее на фильтровальную бумагу (или бумаж
ное полотенце) с помощью пинцета (обычного типа). Захватывают тестируемую рыбу пинцетом за боковые
поверхности головы, чтобы предотвратить ломку хвоста.
3 Вытирают воду с поверхности тела тестируемой рыбы фильтровальной бумагой (или бумажным поло
тенцем).
4 Кладут рыбу на спинку.Делаютмалыйпоперечный разрезбрюшка от проекции затылка досередины брюш
ной области с помощью препарационных ножниц.
5 Вставляют лрепарационные ножницы в разрез и расширяют его от задней части жабр до ануса вдоль сред
ней линии живота. Стараются не вставлять ножницы слишком глубоко, чтобы не повредить печень и гонады.
6 Проводят следующие операции под бинокулярным микроскопом.
7 Размещают рыбу на спине на бумажном полотенце (или стеклянной чашкой Петри, или на предметном
стекле).
8 Раздвигают стенки брюшной полости тонким пинцетом и вынимают внутренние органы. Также возможно
для экстериориэирования внутренних органов удалить одну сторону стенки брюшной полости в случае необходи
мости.
9 Складываютсоединенную частьпечени ижелчногопузыря, используядругую пару тонкихпинцетов. Захва
тывают желчный проток и отделяют желчный пузырь. Стараются не порвать желчный пузырь.
20