ГОСТ 32031-2012
10.5.3 Окраска по Граму
Культуры, выделенные по 10.5.1.2. окрашивают по Граму (по ГОСТ 30425) и микроскопируют.
Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими, короткими палочками.
10.5.4 Определение подвижности
Культуру, выделенную по 10.5.1.2, пересевают в триптои-соевый бульон с дрожжевым экс
трактом (см. 6.5.2.1) или в другую жидкую питательную среду (см. 6.5.2.2 - 6.5.2.3).
Посевы культивируют при температуре (25
±
1) °С от 8 до 24 ч до появления мутности в буль
оне. Затем каплю культуральной жидкости помещают на предметное стекло и накрывают сверху по
кровным стеклом и микроскопируют.
В поле зрения микроскопа должны наблюдаться короткие палочки с опрокидывающими дви
жениями.
При культивировании посевов в жидкой питательной среде при температуре выше (25
±
1) °С
подвижность бактерий не наблюдается.
В качестве альтернативного теста определения подвижности можно использовать посев куль
туры уколом в питательную среду (см. 6.6.4).
Посевы культивируют в термостате при температуре (25
±
1) °С в течение 48 ч.
Бактерии рода Listeria подвижны при температуре (25
±
1) °С, образуют характерный рост во
круг линии укола, похожий на зонтик. Если рост слабый необходимо культивировать еще пять суток с
ежедневным просмотром посевов.
10.5.5 Характеристика бактерий рода Listeria
Бактерий рода Listeria - это грамположительные короткие тонкие палочки, каталазололожи-
тельные, подвижные при температуре не выше (25
±
1) °С.
10.6 Идентификация бактерий рода Listeria (см. 10.5.5) до вида
Культуры, полученные по 10.5.1.2 и соответствующие 10.5.5. идентифицируют следующими
методами.
10.6.1 Определение бета-гемолитической активности
10.6.1.1 С использованием кровяного агара
Поверхность кровяного агара (см. 6.7.1.1) перед использованием необходимо тщательно
подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и проколоть каждый
маркированный квадрат бактериальной иглой с колонией культуры отобранной с триптон-соевого
агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с кровяным агаром, кроме исследуе
мых культур, должны быть посеяны контрольные штаммы, такие как L. monocytogenes (положитель
ный контроль) и L. innocua (отрицательный контроль).
Посевы культивируют при температуре (37
±
1) °С в течение (24
±
2) ч.
Зона р-гемолиза на кровяном агаре у культуры L. monocytogenes - в виде узкой, чистой, свет
лой зоны: L. innocua - нет зоны гемолиза вокруг укола; L. seeligeri - слабая зона гемолиза: L. ivanovii -
широкая, четко обозначенная зона гемолиза.
После инкубирования проводят визуальное сравнение прозрачности зон вокруг анализируе
мых и контрольных культур.
П р и м е ч а н и е - Зона (3-гемолиза более четко видна при удалении колонии с поверхности
агара вокруг места посева.
10.6.1.2 С использованием суспензии эритроцитов барана
В 0.15 см3триптон-соевого бульона с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.2.1) необходимо внести
одну колонию культуры полученную по 10.5.1.2 и соответствующую 10.5.5.
Посевы культивируют при температуре (37
±
1) °С в течение 24 ч. Затем добавляют 0,15 см3
суспензии эритроцитов барана (см. 6.7.1.2) и продолжают культивирование при температуре (37
±
1)
°С от 15 до 60 мин. с последующим охлаждением при температуре(3
±
2) °С около 2 ч.
При наличии у культуры гемолитической активности - жидкость окрашена в соломенно
коричневый цвет и отсутствует осадок красных кровяных клеток на дне лунки.
При отсутствии гемолитической активности наблюдается осадок красных кровяных клеток на
дне лунки. Клетки могут быть красно-коричневыми по цвету.
Если реакция неопределенная, следует оставить культуру при температуре(3
±
2) °С на 24 ч.
10.6.2 Определение лецитиназной активности
Поверхность лецитин-агара с активированным углем (см. 6.6.5) и без угля(см.
6.6.5) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесо
образно разделить на квадраты и высевать на каждый маркированный квадрат бактериальной пет
лей колонию культуры отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На
6