ГОСТ 10444.7-86 С. 13
Непосредственно после появления признаков роста микроорганизмов и затем на 3-е и 5-е сут из
посевов отбирают пастеровской пипеткой со дна культуральную жидкость для окраски по Граму,
окраски спор, фазово-контрастного микроскопировання и пробы на каталазу по ГОСТ 30425—97.
В препаратах устанавливают морфологию бактерий, отмечают наличие типичных клостридиальных кле
ток, наличие и относительную интенсивность спорообразования и место локализации спор внутри
клеток. За 18—24 ч культура С. botulinum образует грамположительные палочки с закругленными
концами различной длины и ширины (приложение 1). При старении культуры в ней поваляются
клетки, не окрашивающиеся по Граму, и спорообразующие клетки обычно в виде ракеток и отдель
ные споры. Возбудители ботулизма в чистой культуре каталазу не образуют.
После появления признаков роста микроорганизмов пятидневную культуральную жидкость из
всех посевов одновременно или последовательно исследуют на присутствие ботулипических токсинов и
ботулинических протоксинов по п. 5.1.
Исследование начинают с тех посевов, в которых признаки развития С. botulinum выражены
наиболее четко; исследование прекращают при обнаружении ботулинического токсина или ботулини-
ческого протокеина хотя бы в одном из посевов. В случае необходимости допускается начинать исследо
вание культуральной жидкости раньше, но заключение об отсутствии ботулинического токсина может
быть дано только на основании исследования пятидневной культуры.
Обнаружение в культуральной жидкости ботулинического токсина или протоксина и клостриди
альных клеток указывает на присутствие в посеве токсигенного штамма С. botulinum. Устанавливают
тип обнаруженного токсина или протоксина и тем самым тип С. botulinum, присутствующего в
посеве.
5.5. Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum
5.5.1. Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum проводят при получении
нечетких результатов по нейтрализации и (или типировании ботулинических токсинов в исходной
жидкости).
5.5.2. Культуру токсигенных штаммов С. botulinum выделяют одновременно с (или после) обна
ружением ботулинического токсина и (или) мезофильных клостридий в продукте или в культураль
ной жидкости. Для выделения отбирают те части продукта или те посевы, в которых обнаружены
спорообразующие клостриднальные клетки и в которых спорообразование протекало наиболее интен
сивно.
Жидкую фазу продукта или экстракт из продукта или культуратную жидкость отбирают пасте
ровской пипеткой из толщи продукта или со дна пробирки или флакона и по 1- 2 см ’ переносят в три
стерильные пробирки; продукт или культуральная жидкость первой пробирки предназначены для
непосредственного высева на плотные питательные среды, второй —для высева после предварительно го
прогрева, третьей — для высева после обработки спиртом.
Содержимое второй пробирки прогревают при (60±1) *С или при (80±1) *С в течение 15 мин.
Содержимое третьей пробирки смешивают с равным объемом спирта, укупоривая пробирку так.
чтобы во время выдержки спиртовой смеси спирт не улетучивался из пробирки.
5.5.3. Для выделения токсигенных штаммов С. botulinum применяют печеночно-желточный агар,
желточный агар для анаэробов или агар кровяной с глюкозой или питательный агар с яичным желт
ком и лактозой. Продукт или культуральную жидкость отбирают из пробирок пастеровской пипеткой,
наносят каплю на поверхность среды и втирают в нее шпателем, получая изолированные колонии. Для
этого одним шпателем последовательно засевают три-четыре чашки Петри, перенося посевной матери ал
шпателем изодной чашки в другую. Чашки с посевами термостатируют при (30±1)*С — (36±1) *С в
течение 48 ч в анаэробных условиях по ГОСТ 30425—97.
5.5.4. На поверхности плотных сред С. botulinum образует выпуклые или плоские, гладкие или
шероховатые, обычно немного расплывчатые колонии с ровными или разрезанными краями. На пече
ночно-желточном агаре колонии окружены «жемчужной» зоной (кроме типа G). которая повторяет
контур колоний; кроме этого, колонии С. botulinum типов Л и В имеют обычно узкую, до 2 мм, зону
преципитации, типов С, D, Е широкую до 4 мм. зону преципитации. На сахарно-кровяном агаре
колонии С. botulinum типов А. В, С, D, Е, F окружены зоной (J-гемолиза. С. botulinum типа G
гемолиза не дает.
Для подтверждения принадлежности выделенных колоний к клострилиям определяют отсутствие
каталазы по ГОСТ 30425-97.
Бактериологической петлей из 5—10 колоний, имеющих характерные для С. botulinum свойства,
отбирают посевной материал и переносят его соответственно в 5 - 10 пробирок с питательными среда
ми. посевы термостатируют, устанавливают присутствие в них и тип С. botulinum.
259